Chƣơng 3– KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ
3.3.4. Kết quả phân tích phần mềm IMAGEJ
Sau khi điện di, nhuộm bạc và scan các bản gel, ta sử dụng hình ảnh để phân tích bằng phần mềm Image J. (Hình 20)
Hình 20- Hình ảnh bản gel khi phân tích bằng phầm mềm ImageJ
Khi sử dụng phầm mềm ImageJ khoanh các vùng cần phân tích, phần mềm sẽ cho ta hình ảnh của các băng biểu diễn qua các đỉnh, dựa vào độ đậm và rộng của các băng. Đánh dấu vùng cần tính diện tích ta có thể dễ dàng tính diện tích các đỉnh. Từ đó có thể thu đƣợc số liệu để đánh giá biến đổi số lƣợng bản sao ở mỗi mẫu.
Đối chiếu kết quả tỉ số mt/ACTB của các mẫu khi phân tích bằng HPLC và phân tích bằng phần mềm ImageJ khơng sai lệch nhiều, các mẫu tăng giảm đều cho kết quả tƣơng ứng (số liệu đƣợc cung cấp đầy đủ ở phần phụ lục).
3.3.4.1. Phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lượng bản sao mtADN và
đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú và u xơ vú từ các kết quả phân tích bằng phần mềm ImageJ
Tƣơng ứng với các mẫu phân tích HPLC, chúng tơi tiến hành phân tích song song bằng phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ với 46 bệnh nhân nhân ung thƣ vú và 20 mẫu bệnh nhân u xơ vú. Trong đó có 46 mẫu mơ u và lân cận u của bệnh nhân ung thƣ vú, 20 mẫu mô và 19 mẫu máu của bệnh nhân u xơ vú. Các biến đổi số lƣợng bản sao mtADN đƣợc xem xét dựa trên tỉ số mt/ACTB của các mẫu và so sánh với nhiều đặc điểm bệnh học.
Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo loại mẫu
Xem xét trên hai đối tƣợng bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú, về phƣơng diện loại mẫu chúng tôi thu đƣợc kết quả ở bảng 10.
Bảng 10. Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú bằng phƣơng pháp ImageJ
Loại mẫu Số lƣợng Trung bình tỉ số
mt/ACTB P Mô lân cận u Mô u 46 46 3,4 2,7 0,058 Mô u Mô u xơ 46 20 2,7 2,48 0,131 Mô u xơ Máu 20 19 2,48 3,1 0,595
Chú thích: Kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney (giá trị P).
Bằng cách sử dụng phƣơng pháp kiểm định phi tham số Mann-Whitney cho từng cặp nhóm mẫu ở bệnh nhân ung thƣ và bệnh nhân u xơ vú. Ở kết quả phân tích bằng phần mềm ImageJ, các số liệu cho thấy xu hƣớng tƣơng ứng với phân tích
21). Ở bệnh nhân u xơ vú, số lƣợng mtADN ở các mẫu mơ u có xu hƣớng giảm so với máu, tuy nhiên sai khác này khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Giữa mẫu mô u ung thƣ và mẫu mô u xơ, số lƣợng bản sao mtADN khơng có sự sai khác rõ rệt với giá trị trung bình tỉ số mt/ACTB tƣơng đƣơng nhau (p > 0,05). Ở bệnh nhân ung thƣ vú, mẫu mơ u có xu hƣớng số lƣợng bản sao mtADN giảm so với các mẫu lân cận u, tuy nhiên, sự sai khác này mặc dù khơng có ý nghĩa thống kê với p<0.05 nhƣng giá trị p cũng nhỏ (p=0,058). Kết quả này sai khác một chút so với kết quả phân tích bằng phƣơng pháp HPLC. Nhƣ vậy, phƣơng pháp ImageJ có thể sử dụng để nhận biết xu hƣớng biến đổi số lƣợng bản sao ở các mẫu nhƣng khơng cho độ chính xác cao nhƣ phƣơng pháp HPLC.
Hình 21- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình theo loại mẫu phân tích bằng phƣơng pháp ImageJ.
Biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thư vú
Tiến hành phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lƣợng bản sao mtADN với các đặc điểm bệnh học của các bệnh nhân ung thƣ vú đựa trên các số liệu thu đƣợc bằng phƣơng pháp phân tích ImageJ, chúng tơi thu đƣợc kết quả ở bảng 11.
Bảng 11. Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thƣ vú phân tích bằng phƣơng pháp ImageJ
Đặc điểm Số lƣợng Trung bình tỉ số
Tuổi <50 ≥50 21 25 2,9 2,4 0.0427 Độ biệt hóa Rõ Vừa Kém 2 25 10 1,85 2,98 2,81 0.336* Kích thƣớc khối u < 5cm ≥ 5cm 24 22 2,18 3,24 0.000246 Mức độ xâm lấn của khối u (T) T1,2 T3,4 35 10 2,74 2,6 0,341 Hạch di căn (N) N0 N1,2 21 24 2,67 2,75 0,468 Giai đoạn bệnh I II III 18 3 24 2,73 2,3 2,75 0,677*
Chú thích: Giai đoạn I: T2N0M0; giai đoạn II: T3,4N0M0; giai đoạn III: T2-4N1,2M0;
kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney và test Kruskal-Wallis (*) (giá trị P).
Tƣơng ứng với các kết quả phân tích bằng phƣơng pháp HPLC, chúng tơi thu đƣợc kết quả phân tích bằng ImageJ ở bệnh nhân ung thƣ vú. Biến đổi số lƣợng bản sao có liên quan đến nhóm tuổi và kích thƣớc khối u. Cụ thể là có hiện tƣợng giảm số lƣợng bản sao mtADN ở nhóm tuổi từ 50 trở lên so với nhóm dƣới 50 tuổi (p < 0,05) và hiện tƣợng tăng số lƣợng bản sao ở nhóm có kích thƣớc khối u lớn hơn 5cm so với nhóm có kích thƣớc khối u nhỏ hơn 5cm (p < 0,05).
Ở các khía cạnh khác nhƣ theo mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và theo giai đoạn bệnh, kết quả thu đƣợc cũng theo chiều hƣớng tƣơng tự với kết quả phân tích HPLC. Khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm theo đặc điểm bệnh học (p > 0,05).
Qua so sánh giữa 2 phƣơng pháp phân tích bằng HPLC và ImageJ, kết quả phân tích mặc dù có sai khác nhƣng vẫn tn theo cùng xu hƣớng biến đổi (ví dụ, tỉ số mt/ACTB của mẫu mô lân cận u cao hơn so với mẫu mô u, của máu cao hơn mô u xơ , của nhóm tuổi trên 50 thấp hơn nhóm dƣới 50, …).
Nhƣ vậy có thể thấy, mặc dù phƣơng pháp phân tích ImageJ khơng cho kết quả chính xác bằng HPLC, tuy nhiên, phƣơng pháp này có ƣu điểm là phƣơng pháp đơn giản, cho kết quả nhanh, chi phí rất thấp. Vì vậy, có thể kết hợp phƣơng pháp sử dụng ImageJ với HPLC hoặc PCR định lƣợng để đánh giá số bản sao mtADN. Phƣơng pháp này thích hợp để áp dụng ở các cơ sở không đƣợc trang bị các thiết bị đắt tiền nhƣ HPLC hoặc thiết bị PCR định lƣợng.
Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã tiến hành phân tích trên 46 bệnh nhân ung thƣ vú và 20 bệnh nhân u xơ vú để nghiên cứu biến đổi số lƣợng bản sao mtADN. Kết quả của chúng tôi cho thấy ở bệnh nhân ung thƣ vú, số lƣợng bản sao mtDNA trong mô u thấp hơn đáng kể so với mô lân cận u tƣơng ứng. Chứng tỏ rằng biến đổi số lƣợng bản sao mtADN có thể dẫn đến một khiếm khuyết chức năng ti thể dẫn đến hình thành khối u ác tính. Số bản sao mtADN giảm trong mô u so với mơ lân cận u cũng đƣợc tìm thấy trong bệnh ung thƣ biểu mô gan [38], bệnh ung thƣ dạ dày [33]. Bên cạnh đó, giảm số lƣợng bản sao mtADN có liên quan với nhóm tuổi của các bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên. Kết quả này phù hợp với các quan sát trƣớc đây trên thế giới nhƣ trong nghiên cứu năm 2007 của Yu và cs, trong 59 trƣờng hợp bệnh nhân ung thƣ vú có 46 (78%) mẫu có hiện tƣợng giảm số lƣợng bản sao mtADN trong mô u so mô lân cận u tƣơng ứng, hiện tƣợng này cũng thấy xuất hiện thƣờng xuyên hơn ở nhóm cao tuổi ≥ 50 tuổi (63%) so với nhóm tuổi < 50 (33%) [39]. Tuy nhiên, nghiên cứu trên các bệnh nhân ung thƣ vú ngƣời Trung Quốc, Xia và cs (2009) lại khơng tìm thấy mối liên quan giữa số bản sao ADN ti thể với nhóm tuối của bệnh nhân [35].
Trong nghiên cứu này, chúng tơi cịn tìm thấy số lƣợng bản sao mtADN tăng ở nhóm có kích thƣớc khối u từ 5cm trở lên so với nhóm có kích thƣớc khối u nhỏ hơn 5cm. Nhƣ vậy, ngƣợc với quá trình hình thành khối u, sự giảm số lƣợng bản sao ADN có thể dẫn đến khiếm khuyết chức năng trong quá trình trao đổi năng lƣợng, ảnh hƣởng đến hoạt động hô hấp của tế bào, hay thay đổi chức năng trong quá trình apoptosis...dẫn đến việc hình thành các tế bào đột biến và cho chúng khả năng bất tử trở thành các khối u ác tính thì việc tiến triển của các khối u có thể địi hỏi nhiều năng lƣợng hơn để đáp ứng nhu cầu của những tế bào tăng sinh vô hạn, dẫn đến việc tăng số lƣợng bản sao mtADN.
Dựa trên mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và giai đoạn bệnh chúng tơi khơng tìm thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm. Điều này khơng tƣơng đồng với kết quả mà Xia và cs (2009) đã chỉ ra rằng có hiện tƣợng biến đổi số lƣợng bản sao mtADN giữa các giai đoạn bệnh với p < 0,05 [35].
Ở bệnh nhân u xơ vú, chúng tơi khơng tìm thấy sự khác biệt đáng kể nào về số lƣợng bản sao mtADN giữa mẫu máu và mẫu mô của các bệnh nhân. Cũng khơng có sự sai khác giữa mẫu mô u xơ và mẫu mô ung thƣ.
Hiện nay, ở Việt Nam, chƣa có nghiên cứu nào về biến đổi số lƣợng bản sao ADN ti thể trong ung thƣ vú nói riêng và các loại ung thƣ khác nói chung, đây sẽ là hƣớng đi có tiềm năng cho việc tìm chỉ thị sinh học của bệnh ung thƣ. Bên cạnh đó, cần tăng số lƣợng mẫu nghiên cứu và kết hợp với các phƣơng pháp định lƣợng khác nhƣ PCR định lƣợng, kết hợp điều tra với các mẫu mô khác nhƣ mẫu máu để khẳng đi ̣nh kết quả nghiên cƣ́u và tăng khả năng ứng dụng thực tiễn.
KẾT LUẬN
Qua các kết quả thu đƣợc từ phân tích biến đổi số bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thƣ vú nguyên phát, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Đã tách chiết thành công 132 mẫu ADN tổng số của 46 bệnh nhân ung thƣ vú (gồm mẫu u và mẫu lân cận u) và 20 bệnh nhân u xơ vú (mẫu mô và máu).
2. Sự giảm số lƣợng bản sao ADN ti thể có liên quan tới sự hình thành khối u và có liên quan đến tuổi của bệnh nhân ung thƣ vú. Ngƣợc lại, số lƣợng bản sao ADN ti thể tăng theo kích thƣớc khối u.
3. Bằng kỹ thuật HPLC và ImageJ đã phân tích đƣợc biến đổi số lƣợng bản sao ADN ti thể của các mẫu, trong đó HPLC là kỹ thuật định lƣợng chính xác, còn ImageJ là kỹ thuật định lƣợng nhanh, hiệu quả và ít tốn kém.
KIẾN NGHỊ
Từ q trình nghiên cứu thực tế chúng tôi đƣa ra một số kiến nghị sau:
1. Tiếp tục phân tích hiện tƣợng biến đổi số lƣợng bản sao ADN ti thể với mẫu ADN tách từ mô của bệnh nhân ung thƣ vú với số lƣợng mẫu lớn hơn.
2. Tiến hành phân tích hiện tƣợng biến đổi số lƣợng bản sao ADN ti thể với mẫu ADN tách từ máu và mô vú c ủa bệnh nhân ung thƣ vú nhằm tìm ra mối tƣơng quan giữa chúng, phục vụ cho chẩn đoán bệnh dựa vào mẫu ADN máu .
3. Kết hợp với các phƣơng pháp đ ịnh lƣợng khác đ ể khẳng định kết quả , góp phần tìm các chỉ thi ̣ sinh ho ̣c cho chẩn đoán và điều tri ̣ bê ̣nh ung thƣ vú .