CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu axit và hấp
hấp thụ nhôm cao từ các chủng được phân lập
Nghiên cứu được thực hiện trên môi trường thạch đĩa:
- Chuẩn bị các đĩa thạch chứa nhôm tương tự như trên với các nồng độ nhôm tăng dần (300 mg/l, 500 mg/l, 700 mg/l).
- Sử dụng que cấy móc để cấy từng khuẩn lạc từ các ống thạch nghiêng vào mỗi đĩa thạch với từng nồng độ nhôm.
- Với mỗi nồng độ nhôm thay đổi, nuôi cấy tại nhiệt độ 30oC trong 2 – 3 ngày để xác định khả năng kháng nhôm của các chủng.
- Sau 2 – 3 ngày nuôi cấy, kiểm tra các đĩa môi trường rồi xác định khuẩn lạc đáp ứng hai trong ba tiêu chí (tiêu chí 1 và 2 hoặc 1 và 3) rồi tuyển chọn:
1. Phát triển tốt nhất ở nồng độ Al3+ cao nhất
2. Sinh khối (khả năng sinh trưởng và phát triển) lớn nhất 3. Mật độ (số lượng khuẩn lạc) lớn nhất
2.2.6. Phương pháp định danh chủng vi sinh vật chịu axit và có khả năng hấp thụ nhôm cao được tuyển chọn
2.2.6.1. Phương pháp định danh dựa vào đặc điểm hình thái
Hình thái tế bào của các chủng VSV tuyển chọn được quan sát dưới kính hiển vi quang học và được chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử sau một tuần nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được nhuộm Gram.
2.2.6.2. Định danh bằng phương pháp phân tử
Để xác định chính xác tên giống- lồi- chủng của các chủng VSV nghiên cứu đề tài sử dụng phương pháp phân tử. Các mẫu VSV tuyển chọn đã thuần khiết được gửi đến phòng xét nghiệm công ty trách nhiệm hữu hạn và dịch vụ Nam Khoa để định danh bằng phương pháp phân tử. Đặc điểm di truyền (dựa vào trình tự 16S rRNA đối với vi khuẩn) và 28S rRNA đối với nấm)) được phòng thực hiện theo các bước như sau:
- Chuẩn bị mẫu cấy thuần khiết - Tách chiết ADN tổng số
Thực hiện tách chiết ADN từ các mẫu VSV tuyển chọn được bằng bộ hóa chất DNA/RNAprep MAGBEAD.
Đo nồng độ ADN (25 – 500 ng/phản ứng) bằng máy Biophotometer - Kỹ thuật PCR
Lấy 5 µl mẫu cho vào phản ứng PCR để khuếch đại đặc hiệu đoạn ADN trên vùng gen 16S rRNA đối với vi khuẩn); vùng gen 28S rRNA đối với nấm) bằng hệ thống máy PCR Thermal Cycler của Bio-Rad.
Bảng 2.4. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR
ước
Vi khuẩn Nấm mốc Số chu kì Nhiệt độ
(oC) Thời gian Số chu kì Nhiệt độ (oC) Thời gian Khởi động 1 95 15 phút 1 95 15 phút Tách mạch 40 94 30 giây 35 94 30 giây Gắn mồi 57 30 giây 62 1 phút Kéo dài 72 1 phút 72 2 phút n định 1 72 10 phút 1 72 10 phút
Kiểm tra sản phẩm điện di: Sau khi PCR kiểm tra mẫu AND bằng phương pháp điện di: tra mẫu vào gen Agarose 2%, chụp hình bằng hệ thống máy Gel Doc của Bio – Rad
- Tinh sạch sản phẩm PCR:
Thực hiện tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ QIA quick PCR Purification Kit của QIAGEN.
Điện di kết quả tinh sạch: điện di kiểm tra kết quả sản phẩm ADN bằng máy hệ thống máy Agilent 2100 Bioanalyzer.
- Giải trình tự gen: PCR SEQ sản phẩm đã tinh sạch trước khi giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3130XL
- Phương pháp phân tích số liệu:
Phân tích kết quả bằng phần mềm Sequecing analysis 5.3.
So với kết quả trên ngân hàng gen và ngân hàng dữ liẹ u NC I National Center for iotechnology Information bằng phần mềm LAST SEARCH asic Local Alignment Search Tool).
2.2.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng chịu axit của các chủng vi sinh vật