Mơi trường Hóa chất Hàm lượng (g/L)
Mơi trường Hansen (nuôi cấy nấm mốc) Glucose 50 Pepton 10 KH2PO4 3 MgSO4.7H2O 2 – 5 Agar 20 Môi trường LB (nuôi cấy vi khuẩn)
Cao thịt 5 Peptone 10
NaCl 5
Agar 15
Phương pháp pha loãng mẫu đất: Tiến hành pha loãng các mẫu đất đã qua xử lý thành các mẫu có độ pha lỗng khác nhau bằng nước cất (10-2 đến 10-5).
Phương pháp phân lập:
- Nhỏ 0,1 ml mẫu đã pha loãng vào mỗi đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên với nồng độ nhôm là 100 mg/l, sử dụng que gạt trải đều trên đĩa rồi nuôi cấy tại nhiệt độ 30oC trong 5 – 7 ngày.
- Sau thời gian ni cấy, chọn các khuẩn lạc riêng biệt có hình thái đặc trưng mọc trên các đĩa thạch, cấy truyền ra các ống thạch nghiêng chứa môi trường phù hợp với từng nhóm VSV (khơng có nhơm để giữ giống.
Tất cả các thí nghiệm trên đều được thực hiện trong điều kiện môi trường sạch và thao tác trong tủ cấy vơ trùng, mỗi thí nghiệm đều được làm lặp lại ít nhất 3 lần.
2.2.5. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu axit và hấp thụ nhôm cao từ các chủng được phân lập hấp thụ nhôm cao từ các chủng được phân lập
Nghiên cứu được thực hiện trên môi trường thạch đĩa:
- Chuẩn bị các đĩa thạch chứa nhôm tương tự như trên với các nồng độ nhôm tăng dần (300 mg/l, 500 mg/l, 700 mg/l).
- Sử dụng que cấy móc để cấy từng khuẩn lạc từ các ống thạch nghiêng vào mỗi đĩa thạch với từng nồng độ nhôm.
- Với mỗi nồng độ nhôm thay đổi, nuôi cấy tại nhiệt độ 30oC trong 2 – 3 ngày để xác định khả năng kháng nhôm của các chủng.
- Sau 2 – 3 ngày nuôi cấy, kiểm tra các đĩa môi trường rồi xác định khuẩn lạc đáp ứng hai trong ba tiêu chí (tiêu chí 1 và 2 hoặc 1 và 3) rồi tuyển chọn:
1. Phát triển tốt nhất ở nồng độ Al3+ cao nhất
2. Sinh khối (khả năng sinh trưởng và phát triển) lớn nhất 3. Mật độ (số lượng khuẩn lạc) lớn nhất
2.2.6. Phương pháp định danh chủng vi sinh vật chịu axit và có khả năng hấp thụ nhôm cao được tuyển chọn
2.2.6.1. Phương pháp định danh dựa vào đặc điểm hình thái
Hình thái tế bào của các chủng VSV tuyển chọn được quan sát dưới kính hiển vi quang học và được chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử sau một tuần nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được nhuộm Gram.
2.2.6.2. Định danh bằng phương pháp phân tử
Để xác định chính xác tên giống- loài- chủng của các chủng VSV nghiên cứu đề tài sử dụng phương pháp phân tử. Các mẫu VSV tuyển chọn đã thuần khiết được gửi đến phịng xét nghiệm cơng ty trách nhiệm hữu hạn và dịch vụ Nam Khoa để định danh bằng phương pháp phân tử. Đặc điểm di truyền (dựa vào trình tự 16S rRNA đối với vi khuẩn) và 28S rRNA đối với nấm)) được phòng thực hiện theo các bước như sau:
- Chuẩn bị mẫu cấy thuần khiết - Tách chiết ADN tổng số
Thực hiện tách chiết ADN từ các mẫu VSV tuyển chọn được bằng bộ hóa chất DNA/RNAprep MAGBEAD.
Đo nồng độ ADN (25 – 500 ng/phản ứng) bằng máy Biophotometer - Kỹ thuật PCR
Lấy 5 µl mẫu cho vào phản ứng PCR để khuếch đại đặc hiệu đoạn ADN trên vùng gen 16S rRNA đối với vi khuẩn); vùng gen 28S rRNA đối với nấm) bằng hệ thống máy PCR Thermal Cycler của Bio-Rad.
Bảng 2.4. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR
ước
Vi khuẩn Nấm mốc Số chu kì Nhiệt độ
(oC) Thời gian Số chu kì Nhiệt độ (oC) Thời gian Khởi động 1 95 15 phút 1 95 15 phút Tách mạch 40 94 30 giây 35 94 30 giây Gắn mồi 57 30 giây 62 1 phút Kéo dài 72 1 phút 72 2 phút n định 1 72 10 phút 1 72 10 phút
Kiểm tra sản phẩm điện di: Sau khi PCR kiểm tra mẫu AND bằng phương pháp điện di: tra mẫu vào gen Agarose 2%, chụp hình bằng hệ thống máy Gel Doc của Bio – Rad
- Tinh sạch sản phẩm PCR:
Thực hiện tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ QIA quick PCR Purification Kit của QIAGEN.
Điện di kết quả tinh sạch: điện di kiểm tra kết quả sản phẩm ADN bằng máy hệ thống máy Agilent 2100 Bioanalyzer.
- Giải trình tự gen: PCR SEQ sản phẩm đã tinh sạch trước khi giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3130XL
- Phương pháp phân tích số liệu:
Phân tích kết quả bằng phần mềm Sequecing analysis 5.3.
So với kết quả trên ngân hàng gen và ngân hàng dữ liẹ u NC I National Center for iotechnology Information bằng phần mềm LAST SEARCH asic Local Alignment Search Tool).
2.2.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng chịu axit của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn
Nghiên cứu các chủng VSV được tuyển chọn trong môi trường dịch thể phù hợp với từng nhóm VSV:
- Pha độ đục chuẩn McFarland đối với các chủng vi khuẩn) (Phụ lục 1).
- Chuẩn bị các môi trường dịch thể phù hợp với từng nhóm VSV (mơi trường khơng chứa thạch) có chứa 100 mg/l nhơm tương tự như trên , chia đều dịch ra các bình nón rồi điều chỉnh pH của môi trường và pH dung dịch nhôm từ pH 3,0 giảm dần xuống đến pH 2,2 bằng dung dịch NaOH hoặc HCl. Thêm một bình với pH 5,0 để đối chứng.
- Nhỏ cùng một thể tích dịch huyền phù các chủng vi khuẩn vào các bình nón chứa dịch thể. Giống nấm mốc được cấy chuyển từ các ống thạch nghiêng vào các bình nón chứa dịch thể, nút kín miệng bình.
- Đặt các bình nón cố định trong tủ ấm lắc tạo mơi trường, thiết lập chương trình chạy máy với tốc độ lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 30oC. Bật tủ lắc trong vịng 5 ngày.
- Sau 5 ngày ni cấy, ly tâm dịch thể với tốc độ 3000 vòng/ phút trong 15 phút rồi lọc thu sinh khối. Đánh giá khả năng chịu axit của các chủng thông qua sinh khối thu được.
- Riêng đối với vi khuẩn do sinh khối tạo thành nhỏ nên đề tài tiến hành nuôi cấy cùng một thể tích dịch huyền phù các chủng vi khuẩn trên các mơi trường thạch đĩa có chứa 100 mg/l nhơm và pH khác nhau; gạt đều trên đĩa. Sau 5 ngày nuôi cấy đếm khuẩn lạc trên đĩa đối với vi khuẩn) để đánh giá khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn.
2.2.8. Nghiên cứu khả năng hấp thụ nhôm của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn chọn
- Pha độ đục chuẩn McFarland đối với các chủng vi khuẩn) (Phụ lục 1).
- Chuẩn bị các môi trường dịch thể phù hợp vời từng nhóm VSV (mơi trường khơng chứa thạch) có chứa nhơm tương tự như trên với các nồng độ nhôm
tăng dần từ 0 – 2000 mg/l. Điều chỉnh pH 3,0 đối với cả môi trường và dung dịch nhôm.
- Nhỏ cùng một thể tích dịch huyền phù của các chủng vi khuẩn vào các bình nón chứa dịc thể. Giống nấm mốc được cấy chuyển từ các ống thạch nghiêng vào các bình nón chứa dịch thể, nút kín miệng bình.
- Đặt các bình nón cố định trong tủ ấm lắc tạo mơi trường, thiết lập chương trình chạy máy với tốc độ lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 30oC. Bật tủ lắc trong vòng 5 ngày.
- Sau 5 ngày, ly tâm dịch thể với tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút, lọc tách sinh khối và dịch lọc. Sinh khối sau khi thu được đem đi sấy khô đến khi khối lượng không đổi. Tiếp tục ly tâm dịch lọc, sau đó phần dịch được qua màng lọc vô trùng k ch thước lỗ 0,25 µm. Đánh giá khả năng kháng nhôm dựa vào sinh khối thu được và khả năng hấp thụ nhôm dựa vào nồng độ nhơm cịn lại trong dịch sau nuôi cấy được xác định bằng phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử.
- Riêng đối với vi khuẩn do sinh khối tạo thành nhỏ nên đề tài tiến hành nuôi cấy cùng một thể tích dịch huyền phù các chủng vi khuẩn trên các mơi trường thạch đĩa có chứa nồng độ nhơm tăng từ 0 – 2000 mg/l và pH 3,0; gạt đều trên đĩa. Sau 5 ngày nuôi cấy đếm khuẩn lạc trên đĩa đối với vi khuẩn để đánh giá khả năng kháng nhôm của các chủng vi khuẩn.
2.2.9. Phương pháp sơ bộ đánh giá khả năng ứng dụng hỗn hợp vi sinh vật nhằm hạn chế hàm lượng nhôm linh động trong đất trồng chè. hạn chế hàm lượng nhôm linh động trong đất trồng chè.
Để đánh giá khả năng ứng dụng hỗn hợp VSV nhằm hạn chế hàm lượng nhôm linh động trong đất trồng chè tiến hành nuôi cấy các chủng VSV trong môi trường đất của khu vực nghiên cứu quy mơ phịng thí nghiệm:
ước 1: Nhân giống tạo hỗn hợp sinh khối của các chủng VSV:
- Chuẩn bị các môi trường dịch thể (không chứa thạch và không chứa nhôm) phù hợp với các chủng VSV (các chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB, các chủng nấm mốc được nuôi trong môi trường Hansen). Khử trùng 100 ml môi trường dịch thể đã được phân phối vào bình nón.
- Sử dụng que cấy móc, cấy truyền từng khuẩn lạc của các chủng VSV từ ống nghiệm giống vào các bình nón chứa dịch thể, nút kín miệng bình.
- Đặt các bình nón cố định trong tủ ấm lắc tạo mơi trường, thiết lập chương trình chạy máy với tốc độ lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 30oC. Bật tủ lắc trong vòng 7 ngày nhằm tăng sinh khối.
- Sau 7 ngày, ly tâm dịch thể với tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút rồi thu sinh khối của các chủng VSV.
ước 2: Cấy các chủng VSV tuyển chọn được vào mẫu đất thuộc khu vực nghiên cứu.
Cân 1 mg sinh khối của mỗi chủng (hai chủng vi khuẩn B2, B4 và ba chủng nấm mốc F8, F13 và F17), rồi phối trộn đều hỗn hợp sinh khối, thu được 5 mg hỗn hợp sinh khối có tỉ lệ (1:1:1:1:1).
Cân 100 g đất của mẫu đất trồng chè MĐ1 vào bình đã khử trùng và bổ sung 5 mg hỗn hợp sinh khối trên phân phối đều vào trong mẫu đất.
Do khả năng chịu axit của nấm mốc thường cao hơn so với vi khuẩn. Nên nấm mốc được cho là chiếm ưu thế trong tổng số VSV chịu axit và kháng nhôm. Mặt khác, trong quá trình nghiên cứu chủng nấm mốc Penicillium janthinellum F17 có hiệu suất hấp thụ nhơm là lớn hơn cả so với hai chủng nấm mốc cịn lại nên tơi bố trí thêm mẫu đất có bổ sung chủng nấm mốc Penicillium janthinellum F17 nhằm đánh giá tiềm năng ứng dụng của chủng F17 so với hỗn hợp VSV. Cân 5 mg sinh khối của chủng nấm mốc F17 sau đó phân phối vào 100 g đất của mẫu đất trồng chè MĐ1 do chủng nấm mốc F17 có hiệu suất hấp thụ nhơm tương đối cao nên đã được lựa chọn để thử nghiệm.
Thực tế trong đất đã chứa hệ VSV đất hoạt động thường xun, chính vì vậy để đánh giá khả năng ứng dụng của các chủng VSV nghiên cứu tơi bố trí thêm mẫu đối chứng (mẫu đất không bổ sung VSV). Chuẩn bị thêm 100 mg đất không bổ sung hỗn hợp VSV vào bình đã khử trùng để đối chứng.
Sau đó sử dụng giấy bạc đậy kín các miệng bình.
ước 3: Tiến hành ủ mẫu đất đã bổ sung hỗn hợp sinh khối của các chủng VSV ở nhiệt độ 30oC trong 7 ngày.
Sau 7 ngày xác định hàm lượng nhôm linh động trong các mẫu đất trồng chè (mẫu đối chứng) và mẫu đất sau khi ủ (mẫu thí nghiệm để so sánh và đánh giá khả năng ứng dụng các chủng VSV nghiên cứu vào thực tiễn.
2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu.
Dựa vào các số liệu thứ cấp và số liệu phân tích trong phịng thí nghiệm, xử lý số liệu bằng phần mềm thống kê trong Excel và phương pháp thống kê sinh học như đếm số lượng, tính tốn mật độ VSV và lấy giá trị trung bình.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Một số tính chất cơ bản và hàm lƣợng nhôm tổng số của đất trồng chè vùng Tân Cƣơng, Thái Ngun
3.1.1. Một số chỉ tiêu lí, hóa học của đất
Nhận thấy đất tại khu vực xã Tân Cương là đất phù sa cổ. Đất có đặc điểm chung là màu vàng đậm và nhiều đá sỏi xen lẫn với các k ch thước khác nhau. Phân tích các chỉ tiêu lí, hóa học của các mẫu đất thuộc khu vực nghiên cứu, tôi thu được kết quả (Bảng 3.1) và một số nhận xét như sau:
Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu lí, hóa học của các mẫu đất nghiên cứu
Mẫu pH (H2O) Độ ẩm (%) Nhôm tổng số (mg/kg đất) Chất tổng số C (%) N (%) MĐ1 4,29 27,7 73,5 1,37 0,20 MĐ2 3,68 28,0 97,4 1,07 0,11 MĐ3 3,46 28,0 38,6 1,17 0,30 a) Độ chua – pH (H2O)
Độ chua của đất là một chỉ tiêu quan trọng được sử dụng trong việc bố tr cơ cấu cây trồng phù hợp trên vùng đất canh tác, ảnh hưởng đến sự phân giải các chất khó tiêu trong đất, cũng là một trong những tiêu chí quan trọng đánh giá độ phì nhiêu của đất. Đặc biệt cây chè rất phù hợp trồng trên đất có tính axit. Đối với cây chè, độ chua là yếu tố quan trọng quyết định đến năng suất của cây chè, vì vậy kiểm tra độ pH là cơng tác cần được tiến hành thường xuyên. Nếu pH lớn hơn hoặc nhỏ hơn khoảng thích hợp sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển và chất lượng của cây chè. Đối với các loại cây trồng nơng nghiệp nói chung, các loại cây ăn quả và hoa, khoảng pH thích hợp dao động từ 5,5 – 8,0; đối với cây công nghiệp thì pH thấp hơn, khoảng 5,0 – 6,5. Riêng đối với cây chè được trồng trên đất có giá trị pH trong khoảng 4,5 – 5,5 được xem là tốt nhất cho việc đồng hoá các chất dinh dưỡng [66].
Trong nghiên cứu, các mẫu đất nghiên cứu đều có phản ứng chua pH (H2O) dao động từ 3,46 - 4,29. Đất biểu hiện bị chua hóa có thể do hoạt động thâm canh, nhất là mức độ sử dụng phân lân cao liên tục trong những năm gần đây ở khu vực nghiên cứu. Thêm vào đó, theo khảo sát thì hàng năm các hộ trồng chè còn bổ sung thêm một lượng lớn các vật liệu hữu cơ để ủ gốc cho chè, thời gian dài quá trình phân hủy các vật liệu hữu cơ này cũng sinh ra các axit hữu cơ, từ đó làm tăng độ chua của đất. Mẫu MĐ1 có giá trị pH rất thích hợp cho việc trồng chè, trong khi đó mẫu MĐ2 và MĐ3 giá trị pH tương đối thấp (pH (H2O) 3,68 và 3,46). Với các giá trị pH này của đất, cây chè vẫn có khả năng th ch nghi cho dù khơng phải ở phạm vi tốt nhất. Theo thời gian, đất trở nên chua hơn bởi việc sử dụng HCBVTV, tạo điều kiện cho sự t ch lũy Al3+ tăng cao.
b) Độ ẩm
Nước là yếu tố vô cùng quan trọng cho sự phát triển của cây trồng. Cây trồng sống và phát triển được nhờ chất dinh dưỡng trong đất và được nước h a tan, đưa lên cây qua hệ thống rễ. Nước giúp cây trồng thực hiện các quá trình vận chuyển các chất khoáng trong đất giúp điều kiện quang hợp, hình thành sinh khối tạo nên sự sinh trưởng của cây trồng. Nước cũng là yếu tố ch nh tạo độ ẩm cho đất. Đối với các loại đất trồng nói chung thì độ ẩm dao động từ 40 – 80 %, tuy nhiên với đất chè thì khơng cần độ ẩm cao bởi đây không phải là loại cây trồng ưa ẩm. Theo nghiên cứu của một số cơng trình, độ ẩm của đất trồng chè cao nhất là vào mùa mưa tháng 5 – 9 hàng năm , khoảng 34 – 37 % và thấp nhất là vào mùa khô tháng 10 đến tháng 3 năm sau , khoảng 20 – 23 % [4].
Đất chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên được thu mẫu nghiên cứu vào tháng 2/2018 có độ ẩm trung bình, từ 27,7 – 28,0%. Tại trước thời điểm thu mẫu 2 – 3 ngày, ở địa phương có mưa phùn nhỏ, tuy nhiên lượng mưa không đáng kể nên không ảnh hưởng đến độ ẩm khi thu mẫu. Với độ ẩm khoảng 28 % là khoảng độ ẩm th ch hợp cho sự phát triển của cây chè. Đất chè có độ ẩm trung bình cây chè vẫn có