TT
K hiệu
chủng Đặc điểm hình thái
Nguồn gốc phân lập 1 B1 Khuẩn lạc to, màu trắng đục, phát triển nhanh MĐ1 2 B2 Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục phớt hồng MĐ3 3 B3 Khuẩn lạc có váng mỏng, trắng đục MĐ1 4 B4 Khuẩn lạc có váng dày, khơ, màu trắng MĐ2 5 B5 Khuẩn lạc có váng mỏng, ướt, màu phớt hồng MĐ1 6 B6 Khuẩn lạc khô, mép nhăn, màu trắng đục MĐ3 7 B7 Khuẩn lạc mỏng, ướt, màu vàng MĐ1 8 B8 Khuẩn lạc mỏng, ướt, mép trơn, màu trắng đục MĐ2 9 B9 Khuẩn lạc váng dày, mép nhăn, màu trắng MĐ1 10 B10 Khuẩn lạc váng dày, mép nhăn, màu hồng MĐ3 11 B11 Khuẩn lạc váng dày, mép nhăn, màu trắng MĐ1 12 B12 Khuẩn lạc váng dày, mép nhăn, khô, màu trắng MĐ2 13 F1 M àu xanh xám đậm, tr n đều, bề mặt nổi có rìa ngồi
vịng trịn, d = 9 mm MĐ1 14 F2 Màu xám, bề mặt xốp, tr n đều, phần tâm màu xám
đậm hơn, d = 20 mm MĐ2 15 F3 Màu xanh xám, tr n đều, phần tâm màu đậm hơn, d =
20 mm MĐ3
16 F4 Màu trắng bông, bề mặt xốp lù xù và lan rộng khoảng
100 mm MĐ1
17 F5 Màu trắng xanh, tr n đều, bề mặt nổi có rìa ngồi v ng
tròn, d = 7 mm MĐ3
tròn, d = 10 mm
19 F7 Màu xanh xám đậm, tr n đều, phần tâm màu nhạt hơn,
d = 20 mm MĐ3
20 F8 Màu trắng đục, bông xốp, lan rộng khoảng 50 mm MĐ2 21 F9 Màu xanh xám, tr n đều, ở tâm tạo một v ng tròn màu
nâu xám, d = 20 mm MĐ2 22 F10 Màu trắng đục, tr n đều, từ tâm tạo các rãnh xốy ra
đến viền ngồi, d = 40 mm MĐ2 23 F11 Màu trắng xám nhạt, tr n đều, bề mặt xốp lù xù, d = 15
mm MĐ1
24 F12 Màu xanh xám hơi vàng, tr n đều, bề mặt nổi hơi xốp,
d = 11 mm MĐ2
25 F13 Màu xanh xám, tr n đều, có các v ng tr n đồng tâm
màu xám đậm hơn, d= 19 mm MĐ3 26 F14 Màu trắng, bề mặt xốp lù xù, lan rộng khoảng 60 mm MĐ3 27 F15 Màu xanh lục đậm, bề mặt xốp lù xù, lan rộng khoảng
50 mm MĐ3
28 F16 Màu xanh đen, tr n đều, bề mặt nổi, phần tâm có màu
trắng đục, d = 20 mm MĐ1 29 F17 Màu xanh xám, tr n đều, có các v ng tr n đồng tâm
màu trắng, đường k nh khoảng 40 mm MĐ1
Chú thích: B (Bacteria- Vi khuẩn), F (Fungi - Nấm mốc); d: đường k nh khuẩn lạc;
MĐ: mẫu đất
Trước đây đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chịu axit và kháng nhôm của các chủng VSV như: Ngô Thị Tường Châu và các cộng sự 2014 đã phân lập được 41 chủng vi khuẩn có khả năng chịu axit pH 3,7 và kháng nhôm cao 100 ppm từ đất trồng chè [41]. Hay nghiên cứu của các tác giả Kanazawa và Kunito 1996 cũng đã phân lập được 8 loài nấm mốc từ đất axit có khả năng chịu nhơm với nồng độ 100 mM trên mơi trường thạch dinh dưỡng pha lỗng 10 lần [24]. Có
thể thấy trong điều kiện axit và nồng độ nhôm như vậy các chủng VSV phát triển tương đối tốt và đa dạng.
3.3. Kết quả tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu axit và hấp thụ nhôm phân lập đƣợc từ đất trồng chè vùng Tân Cƣơng, Thái Nguyên lập đƣợc từ đất trồng chè vùng Tân Cƣơng, Thái Nguyên
Trong số các chủng VSV phân lập được thì đề tài tiếp tục tiến hành nuôi cấy các chủng VSV trên trong điều kiện môi trường axit (pH 3,0) chứa hàm lượng Al3+
tăng dần nồng độ nhôm tăng từ 100 mg/l đến 700 mg/l), tôi nhận thấy tất cả các chủng VSV phân lập được đều có khả năng phát triển trên các điều kiện môi trường chứa hàm lượng nhôm khác nhau nhưng sự phát triển của các chủng trên các mơi trường đó là khơng đồng đều, có sự khác biệt rõ rệt. Nấm mốc có sinh khối lớn hơn vi khuẩn nên có thể nhận thấy rõ khả năng phát triển trên mặt thạch với các nồng độ Al3+ tăng dần.
Khi tăng nồng độ nhơm trong các mơi trường ni cấy thì sự phát triển của các chủng cũng giảm dần. Đặc biệt ở nồng độ nhơm cao nhất 700 mg/l thì chỉ có một số chủng có khả năng phát triển tốt như chủng vi khuẩn 2, 4; nấm mốc F8, F13 và F17 còn một số chủng giảm khả năng phát triển hoặc thậm ch không phát triển như các chủng vi khuẩn 6, 10; các chủng nấm mốc như F1, F5, F6, F10... xem phụ lục 2 . Điều này cho thấy khi nồng độ nhơm tăng cao 700 mg/l thì chỉ có một vài chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh, khả năng kháng nhôm của các chủng vi khuẩn 2, 4; nấm mốc F8, F13 và F17 được đánh giá cao hơn so với các chủng c n lại.
Đồng thời dựa vào khả năng đáp ứng ba tiêu ch đã đặt ra tại mục 2.2.5, tôi nhận thấy:
Chủng F8, F17 đáp ứng hai tiêu chí:
- Phát triển tốt nhất ở nồng độ Al3+ cao nhất
- Sinh khối (khả năng sinh trưởng và phát triển) lớn nhất
Chủng 2, B4, F13 đáp ứng hai tiêu ch :
- Phát triển tốt nhất ở nồng độ Al3+ cao nhất
Vì vậy hai chủng vi khuẩn (B2 và B4), ba chủng nấm mốc (F8, F13 và F17) đã được tuyển chọn để nghiên cứu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4. Kết quả định danh các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nhơm cao đã đƣợc tuyển chọn
Sau một tuần ni cấy trên các mơi trường thích hợp khơng chứa nhơm, quan sát đặc điểm hình thái của các chủng VSV đã được tuyển chọn phục vụ cho công tác định danh. Đồng thời dựa vào kết quả định danh bằng phương pháp xác định trình tự 16S rRNA đối với vi khuẩn) và 28S rRNA đối với nấm mốc) tôi thu được các kết quả như sau:
3.4.1. Kết quả định danh chủng vi khuẩn B2
Chủng B2 có khuẩn lạc màu xám trắng, bề mặt khơ. Tế bào chủng vi khuẩn B2 có dạng que, nhỏ, hai đầu trịn và thuộc nhóm Gram dương (hình 3.1).
Hình 3.1. Hình thái tế bào (×100) của chủng vi khuẩn B2
Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng B2 bằng phần mềm Sequecing Analysis 5.3 hình 3.2 , đồng thời so sánh trình tự này với cơ sở dữ liệu của GenBank và NCBI bằng phần mềm BLAST (hình 3.3) cho thấy: độ dài đoạn gen giải trình tự là 503 bp, trình tự này tu o ng đồng 100% với trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng Bacillus subtilis.
Hình 3.3. Kết quả so sánh chi tiết từng trình tự tương đồng của chủng B2 được tra cứu trên NCBI
Vì vậy trong nghiên cứu này, chủng 2 được định danh là Bacillus subtilis
2. Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng Bacillus subtilis được lưu giữ trong cơ sở dữ liệu của GenBank với mã số truy cập CP021985.1. Vi khuẩn Bacillus sp.
cũng đã được rất nhiều tác giả nghiên cứu trước đó về khả năng chịu axit và kháng nhơm cao. Điển hình như nghiên cứu của tác giả Ngơ Thị Tường Châu và các cộng sự 2014 cũng đã phân lập và xác định được vi khuẩn Bacillus sp. có khả năng phát triển được trong mơi trường S-LB có tính axit (pH 3,7); chứa 1,0 g/l và có khả năng tồn tại trong môi trường LB chứa 10 g/l Al (pH 2,0). Có thể thấy vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh trưởng tương đối mạnh trong một số điều kiện môi trường khắc
nghiệt và được đánh giá cao trong việc thích ứng với điều kiện mơi trường chua (pH <5 , hàm lượng nhôm cao. [41]
3.4.2. Kết quả định danh chủng vi khuẩn B4
Đối với chủng vi khuẩn B4 được tuyển chọn, đặc điểm khuẩn lạc của chúng có váng dày, khơ. Trên mơi trường thạch dinh dưỡng NA khuẩn lạc lan rộng trên bề mặt thạch có mép nhăn, khá dày. Bên cạnh đó, tế bào chủng vi khuẩn B4 có dạng que, ngắn và thuộc nhóm Gram âm (hình 3.4).
Hình 3.4. Hình thái tế bào (×100) của chủng B4
Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng B4 bằng phần mềm Sequecing Analysis 5.3 được thể hiện trong hình 3.5 có độ dài 513 bp. So sánh trình tự này với cơ sở dữ liệu của GenBank và NCBI bằng phần mềm BLAST (hình 3.6) cho thấy trình tự này tu o ng đồng 100% với trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng Burkholderia cenocepacia (mã số truy cập CP019668.1). Vì vậy
chủng 4 được xếp vào chi Burkholderia, loài Burkholderia cenocepacia. Trong
nghiên cứu này, chủng vi khuẩn 4 được định danh là Burkholderia cenocepacia
B4.
Hình 3.6. Kết quả so sánh chi tiết từng trình tự tương đồng của chủng B4 tra cứu trên NCBI
3.4.3. Kết quả định danh chủng nấm mốc F8
Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nấm mốc F8 cho thấy khuẩn lạc chủng F8 có màu trắng, mặt dạng nhung và đường k nh khoảng 50 mm hình 3.7). Đồng thời dựa vào kết quả phân tích trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng F8 bằng phần mềm Sequecing Analysis 5.3 (hình 3.7) và so sánh trình tự này với cơ sở dữ liệu của GenBank và NC I bằng phần mềm BLAST (hình 3.8) cho thấy độ dài đoạn gen là 256 bp, trình tự này tu o ng đồng 100% với trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng Eupenicillium javanicum AFTOL-ID 429 mã số truy cạ p EF413621.1). Vì vậy chủng F8 đu ợc xếp vào chi Eupenicillium, lồi Eupenicillium javanicum và
Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch Sabouraud và trình tự gen 28S rRNA của chủng F8
Hình 3.8. Kết quả so sánh chi tiết từng trình tự tương đồng của chủng F8 tra cứu trên NCBI
Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy một số loài nấm mốc thuộc chi
Eupenicillium có khả năng chịu axit và kháng nhôm cao như: Eupenicillium
parvum được phân lập từ đất trồng chè có tính axit cao thể hiện khả năng chịu được
hàm lượng nhôm cao (100 mM) [59]. Hay nghiên cứu của Genhe He và các cộng sự cũng đã xác định được chủng Eupenicillium S4 từ núi trồng chè Chingkang thuộc
tỉnh Jiangxi, Trung Quốc. Chủng Eupenicillium S4 có khả năng phát triển trong mơi trường chứa 550 mM Al3+ [18].
3.4.4. Kết quả định danh chủng nấm mốc F13
Quan sát chủng nấm mốc F13 nhận thấy F13 có khuẩn lạc màu xanh xám, tr n đều với các v ng tr n đồng ta m và đường kính khoảng 19 mm (hình 3.9).
Hình 3.9. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch Sabouraud của chủng F13
Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng F13 bằng phần mềm Sequecing Analysis 5.3 (hình 3.10), đồng thời so sánh trình tự này với cơ sở dữ liệu của GenBank và NC I bằng phần mềm BLAST (hình 3.11) cho thấy trình tự này tu o ng đồng 100% với trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng Penicillium
variabile KUC1476 mã số truy cạ p HM469398.1 . Chủng F13 đu ợc xếp vào chi
Penicillium, loài Penicillium variabile. Vì vạ y, trong nghie n cứu này, chủng F13
đu ợc định danh là chủng Penicillium variabile F13.
Hình 3.11. Kết quả so sánh chi tiết từng trình tự tương đồng của chủng F13 tra cứu trên NCBI
3.4.5. Kết quả định danh chủng nấm mốc F17
Quan sát hình thái của chủng nấm mốc F17 cho thấy F17 có khuẩn lạc màu xanh xám, tr n đều, v ng tr n đồng tâm màu trắng và đường kính khuẩn lạc khoảng 40 mm (hình 3.12).
Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch và trình tự gen 28S rRNA của chủng F17
Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng F17 bằng phần mềm Sequecing Analysis 5.3, đồng thời so sánh trình tự này với cơ sở dữ liệu của GenBank và NC I bằng phần mềm BLAST (hình 3.13) cho thấy trình tự này tu o ng đồng 100% với trình tự đoạn gen 28S rRNA của chủng Penicillium janthinellum mã số truy cạ p AB293968.1). Vì vậy chủng F17 đu ợc xếp vào chi Penicillium, loài Penicillium janthinellum và định danh là Penicillium janthinellum F17.
Trước đó nghiên cứu chỉ ra rằng Penicillium janthineleum F-13 được phân lập có khả năng kháng nhơm cao. Chủng Penicillium janthineleum F-13 có khả năng phát triển trên mơi trường có bổ sung 100 mM Al3+ [64].
Hình 3.13. Kết quả so sánh chi tiết từng trình tự tương đồng của chủng F17 tra cứu trên NCBI
3.5. Kết quả nghiên cứu khả năng chịu axit của các chủng vi sinh vật đƣợc tuyển chọn
Để đánh giá khả năng chịu axit của các chủng VSV tuyển chọn được, tôi tiến hành nuôi cấy các chủng tuyển chọn được trong môi trường dịch thể phù hợp với từng chủng có sự thay đổi các giá trị pH (từ 2,2 đến 5) và nồng độ nhôm được thêm vào các môi trường không đổi (100 mg/l). Sau 5 ngày lắc liên tục ở điều kiện cài đặt sẵn (30oC và 150 vịng/phút), tơi thu kết quả như sau:
Sau 5 ngày nuôi cấy quan sát dịch thể nhận thấy hầu hết các dịch thể đều bị vẩn đục chứng tỏ vi khuẩn Bacillus subtilis B2 và Burkholderia cenocepacia B4 có thể tồn tại và phát triển trong môi trường LB dịch thể chứa nhôm nồng độ 100 mg/l ở pH từ 2,4 - 5,0. Kết quả thu được còn cho thấy khi pH giảm xuống 3,0 hoặc thấp hơn, môi trường nuôi cấy vi khuẩn B4 trở nên trong hơn rõ rệt và bằng mắt thường không thấy dịch thể vẩn đục ở pH 2,6 và 2,4. Điều này có thể giải th ch khi điều kiện mơi trường có độ axit q cao thì vi khuẩn B4 khơng phát triển hoặc phát triển chậm do vi khuẩn B4 khơng thích hợp với mơi trường quá chua.
Do sinh khối tạo ra của chủng vi khuẩn B4 ở dạng huyền phù, khối lượng sinh khối nhỏ nên đề tài đã tiến hành thực hiện thí nghiệm đếm khuẩn lạc trực tiếp trên đĩa để đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn trong các mơi trường có pH khác nhau. Kết quả được thể hiện trong hình 3.14.
Qua hình 3.14, nhận thấy số lượng tế bào xuất hiện trên môi trường pH 2,6 của vi khuẩn B2 là nhiều nhất (2,3x105 CFU/ml)cònvi khuẩn B4 xuất hiện nhiều nhất trên đĩa thạch có pH 5,0 (2,1x105 CFU/ml . Đồng thời kết quả đếm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn trên đĩa thạch còn cho thấy khi giảm pH xuống 2,4 thì vi khuẩn B2 vẫn phát triển tốt có khoảng 1,9x105 CFU/ml xuất hiện trên đĩa c n số lượng tế bào B2 xuất hiện trên đĩa giảm dần khi pH tăng từ 2,8 lên 5,0. Đối với vi khuẩn B4 khi nuôi trên đĩa thạch, không thấy sự xuất hiện khuẩn lạc nào ở môi trường pH 2,4 và 2,6; số lượng tế bào tăng dần khi pH tăng từ 2,8 lên 5,0. Có thể thấy mơi trường pH <3 khơng thích hợp với sự phát triển của vi khuẩn B4. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này có thể kết luận vi khuẩn Bacillus subtilis B2 phát triển tốt
nhất trong mơi trường pH 2,6 cịn vi khuẩn Burkholderia cenocepacia B4 lại phát triển tốt nhất trong điều pH trên 3,0.
Hình 3.14. Biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn B2 và B4
Tham khảo kết quả của một số nghiên cứu khác đã nghiên cứu về khả năng chịu axit của chủng vi khuẩn Bacillus sp. và nhận thấy chủng vi khuẩn Bacillus sp. cịn có khả năng tồn tại được trong điều kiện pH 2,0 [41]. Có thể nhận thấy chủng vi khuẩn Bacillus sp. có khả năng tồn tại và phát triển tốt trong môi trường axit mạnh.
Sau 5 ngày nuôi cấy trong môi trường Hansen dịch thể chứa nhôm với nồng độ 100 mg/l ở các giá trị pH từ 2,2 - 5,0 trên máy lắc ổn nhiệt tại 30o
C, 150 v ng/phút thì đề tài nhận thấy cả ba chủng nấm mốc Eupenicillium javanicum F8,
Penicillium variabile F13 và Penicillium janthinellum F17 có thể phát triển tốt
trong các mơi trường này, đặc biệt là ở pH 2,4 (hình 3.15 và hình 3.16). Có thể thấy trong điều kiện mơi trường có tính axit mạnh, cả ba chủng đều có khả năng chịu axit và phát triển nhanh, tạo ra sinh khối lớn. Chủng P. janthinellum F17 tạo ra sinh khối