CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Xây dựng quy trình chế tạo phức hệ agarose-curdlan dạng nano
Quy trình tạo phức hệ Agarose/Curdlan mang thuốc Etanercept trung hòa TNF-α (ACE) ở dạng nano được tham khảo từ cơng trình của Wang và cộng sự [64, 65] và kết tinh phức hệ trên bề mặt tinh thể đường D-manitol. Quy trình bao gồm 6 bước:
Bước 1: Hòa tan 20 mg curdlan trong 2 ml dung dịch đệm kiềm NaOH 0.05%, làm tan 30 mg agarose trong 1 ml nước cất ở nhiệt độ 90o
C.
Bước 2: Trộn 2 dung dịch trên với tỷ lệ 700 µl curdlan 1%/NaOH 0.05% và 300µl agarose 3%, đưa tồn bộ hệ này về nhiệt độ phòng và chỉnh pH của hệ về 7.0 bằng 35 μl HCl 1M. Lúc này ta thu được hệ gel 2 thành phần ở dạng bán lỏng.
Bước 3: Đưa 40 µl etanercept có nồng độ 25 mg/ml và phức hệ gel 2 thành phần được hình thành sau bước 2.
Bước 4: Cho toàn bộ hỗn dịch này vào 30 ml dung dịch paraphin liquid, bổ sung 900μl Span 80, tiến hành nghiền đồng thể phức hệ bằng cịi siêu âm với cơng suất 60% của 750w ở nhiệt độ 4oC.
Bước 5: Ly tâm hệ nhũ tương để loại bỏ dịch dầu paraphin bằng cách thêm gấp đơi thể tích của dung mơi phân cực n-Hexane để hòa tan dầu này. Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút, hút bỏ dịch nổi và làm lặp lại 3 lần.
Bước 6: Tạo dạng bột cho phức hệ: Kết hợp hạt mang thuốc (tương ứng có 1 mg ETA/1 ml gel ban đầu) với tinh thể đường D-manitol (100 mg). Dung môi rửa n-Hexane bay hơi tự nhiên trong điều kiện nhiệt độ phòng qua đêm, thu được tương ứng từ 145-150 mg bột gel. Như vậy, trong 1 mg bột gel ACE có tương ứng là 5 µg ETA và được sử dụng trong các thí nghiệm kiểm chứng tương ứng với 1 mg bột phức hệ ACE.
Các phức hệ agarose (A), agarose-curdlan (AC) hay curdlan (C) cũng được làm tương tự nhưng chỉ khác là không chứa thuốc ETA.