CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp
2.2.11. Phương pháp ELISA
Phương pháp ELISA xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, sau đó kháng thể được gắn với một enzyme có khả năng phân giải cơ chất đổi màu. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (TMB) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một sản phẩm có màu xanh da trời, sản phẩm này hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 450 nm.
Tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy trên đĩa 24 giếng với số lương 105 tế bào/ giếng trong điều kiện môi trường DMEM 4,5 mg/ml Glucose (PAN-Biotech) bổ sung 10% FBS (Corning), 1X P/S (PAN-Biotech), ủ qua đêm trong nhiệt độ 37oC và bổ sung 5% CO2. Sau đó, tồn bộ mơi trường được thay thế bằng dung dịch môi trường nuôi cấy DMEM Fresh bổ sung 1% P/S, 1 µg/ml LPS. Mẫu được bổ sung ETA (5 µg/ml hoặc 10 µg/ml), ủ với ACE hoặc AC (1 mg/ml). Sau đó, mơi trường ni tế bào được thu tại các điểm thời gian cụ thể khác nhau (3 h, 10 h, 24 h, 32 h, 48 h, 72 h) để đánh giá nồng độ TNF-α có trong mỗi mẫu bằng phương pháp ELISA.
Lượng TNF-α thực nghiệm được đo bằng máy đọc màu ELISA và được tính tốn dựa trên đường chuẩn được lập ra bởi TNF-α chuẩn của Kit TNF-α bị trung hịa bởi Etanercept sẽ khơng có khả năng bắt cặp với kháng thể TNF-α của Kit ELISA (Thermo). Mỗi lần thí nghiệm sẽ lặp lại 3 giếng đo elisa khác nhau và tồn bộ thí nghiệm sẽ được lặp lại 3 lần bởi 3 người làm độc lập khác nhau, như vậy tổng số giếng cho mỗi thí nghiệm là 9. Vì vậy, từ kết quả đo nồng độ TNF-α có thể suy đốn ra khả năng trung hòa TNF-α của thuốc Etanercept cũng như của phức hệ ACE.