Ta thấy, trong thời gian 3 giờ phân tán trong dung dịch PBS 1x, pH7.4, quan sát bằng mắt thường có thể thấy các khối gel kết dích lại ở các ống có nồng độ phức hệ là 15 và 20 mg/ml. Sau khi tiếp tục ủ các ống nghiệm này trong cùng điều kiện nhiệt độ, có thể thấy ở 3 ống dịch có nồng độ phức hệ cao là 10 mg/ml, 15 mg/ml và 20 mg/ml xuất hiện rất nhiều hạt gel kết dính. Hiện tượng kết dính gel có thể gây nhiễu các thí nghiệm về đặc tính hóa lý của phức hệ cũng như gây ảnh hưởng đến quá trình thử nghiệm trên tế bào. Vì vậy, để loại bỏ hiện tượng này nhóm thí nghiệm sẽ sử dụng ởnồng độ dưới 4 mg/ml cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4. Tác động sinh học của phức hệ lên tế bào
3.4.1. Ảnh hưởng của phức hệ lên khả năng sinh trưởng của các dòng tế bào
Nhằm loại bỏ sai số do tế bào chết khi phức hệ tương tác trực tiếp với tế bào gây ra, chúng tôi kiểm tra độc tính của phức hệ ở một số nồng độ thử nghiệm. Lượng tế bào sống sau khi được ủ với các loại phức hệ thử nghiệm sẽ được so sánh với đối chứng là tế bào được ni cấy trong điều kiện bình thường. Từ đó, kết quả sẽ cho thấy ảnh hưởng của phức hệ ở các nồng độ khác nhau đến quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Các nồng độ phức hệ cho kết quả tỷ lệ tế bào sống lớn hơn giá trị IC 50 sẽ được chấp nhận là không gây độc đến tế bào và được sử dụng trong các thí nghiệm đánh giá đặc tính sinh học khác của phức hệ (Hình 3.7).
So sánh các nhóm thử nghiệm với nhóm đối chứng là tế bào được ni cấy ở điều kiện bình thường ta thấy, khi tăng nồng độ phức hệ trong dung dịch nuôi cấy lên đến 2 mg/ml, lượng tế bào bị ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển rất nhiều. Ngược lại, khi giữ nồng độ phức hệ không vượt quá 1 mg/ml, tế bào gần như hồn tồn phát triển bình thường.
Ngồi ra, nhóm cịn kiểm tra độc tính của phức hệ đối với dòng tế bào đối chứng STO sử dụng trong thí nghiệm đánh giá tính hướng đích. Kết quả cho thấy trên dòng tế bào đối chứng STO có xu hướng tương tự như dòng đại thực bào RAW264.7.
Các kết quả này gần như tương đồng ở 2 nhóm thí nghiệm của các phức hệ mang thuốc ACE và phức hệ không mang thuốc AC trong thời gian tương tác là 24 h đối với cả 2 dòng RAW264.7 và STO. Theo tính tốn cho thấy, các mẫu thí
nghiệm AC và ACE có giá trị IC50 lần lượt là 1.6 và 1.5 trên dòng đại thực bào chuột RAW 264.7 và 1.67 và 1.71 trên dòng nguyên bào sợi chuột STO.
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của phức hệ lên khả năng sinh trƣởng của tế bào RAW264.7 và STO
Thí nghiệm in vitro này cho thấy rằng việc ủ các tế bào có phức hợp (AC
hoặc ACE) ở nồng độ 0,5 mg/ mL không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của chúng tế bào và chỉ giảm nhẹ sự tăng sinh tế bào khi tăng trên nồng độ 1 mg/ml của phức chất đã được sử dụng. Tác động gây chết của các hạt nano đối với các tế bào khi được sử dụng ở nồng độ cao là một quan sát thơng thường ở các thí nghiệm in vitro, có thể được giải thích bằng sự tương tác vật lý giữa các hạt nano và các tế bào. Do kích thước nhỏ của chúng sẽ tạo ra tỷ lệ cao giữa bề mặt và khối lượng, các hạt
0 20 40 60 80 100 120 0 0.5 1 2 4 Tế bào sống (% ) Nồng độ (mg/mL) STO AC ACE 0 20 40 60 80 100 120 0 0.5 1 2 4 T ế b ào số n g (% ) Nồng độ (mg/mL) RAW
nano có thể có độ phản ứng cao hơn trên bề mặt của chúng, cũng có thể ức chế sự tăng sinh tế bào hoặc thậm chí giết chết các tế bào [44]. Các báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng nồng độ ETA dao động từ 1 mg đến 10 mg / mL không ảnh hưởng đến sự tăng sinh tế bào của RAW 264.7 hoặc các dòng tế bào đơn nhân khác ở người [54]. Do đó, chúng tơi đã chọn sử dụng 1 mg nanogel ACE (tương đương khoảng 5 μg / mL ETA), mà không phải là liều thấp hơn, trong các thử nghiệm trên tế bào để nồng độ ETA được giải phóng ở mức đủ để đánh giá hoạt tính trung hịa TNF-α của của nanogel ACE.
3.4.2. Khả năng biểu hiện Dectin-1 trên các dịng tế bào ni cấy
Kết quả thí nghiệm cho thấy khả năng biểu hiên Dectin-1 khác nhau giữa đại thực bào chuột RAW264.7 và nguyên bào sợi phơi chuột STO (Hình 3.8).
Hình 3.8. Biểu hiện Dectin-1 trên 2 dòng tế bào STO và RAW264.7
A. Khả năng biểu hiện Dectin-1 của các dòng tế bào ở mức độ m-RNA được
kiểm tra bằng phương pháp RT-PCR
B. Khả năng biểu hiện Dectin-1 của các dòng tế bào ở mức độ protein được
đánh giá bằng phương pháp Western-bloting
Kết quả thí nghiệm cho thấy, 2 dòng tế bào STO và RAW264.7 khác nhau về khả năng biểu hiện Dectin-1. Đối với dòng đại thực bào 264.7, khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu với Dectin-1 cho thấy mức độ biểu hiện m-RNA cho sản phẩm PCR với 2 băng có kích thước lần lượt là 795 và 700 bp. Đây là 2 isoform của m-RNA Dectin-
1, là một sản phẩm được mã hóa trên cùng 1 locus gen nhưng lại khác nhau về vị trí bắt đầu phiên mã [68]. Với sản phẩm protein tách ra từ dòng tế bào này, khi nhuộm với kháng thể đặc hiệu Dectin-1 thấy xuất hiện băng protein hiện rõ nét nhất ở kích thước 40 kDa đúng bằng kích thước của protein Dectin-1. Từ đây có thể kết luận, đại thực bào RAW264.7 có khả năng biểu hiện mạnh thụ thể Dectin-1 trên cả 2 mức độ m-RNA và Protein, trong khi đó dịng STO khơng có khả năng này. Nhờ khả năng biểu hiện Dectin-1 và khả năng tiết TNF-α cũng như các khả năng biểu hiện các dấu ấn phân tử miễn dịch khác, dòng tế bào này được nhóm sử dụng làm đối tượng thử nghiệm chính cho phức hệ ACE.
Đối với dòng ngun bào sợi phơi chuột STO, kết quả phân tích khơng thấy khả năng biểu hiện Dectin-1 ở cả 2 mức độ m-RNA và protein. Từ đó, dịng tế bào này được sử dụng làm đối chứng âm (-) trong thí nghiệm về khả năng hướng đích của phức hệ đến thụ thể Dectin-1.
3.4.3. Tính hướng đích của phức hệ lên dịng đại thực bào RAW264
Để chứng minh tính hướng đích đặc hiệu của phức hệ tới tế bào có biểu hiện thụ thể Dectin-1, chúng tơi thực hiện thí nghiệm đánh giá tính hướng đích trên hai dịng RAW264.7 có biểu hiện và STO không biểu hiện thụ thể Dectin-1.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, khả năng hấp dẫn của phức hệ làm tăng 70,3 lần (P<0.05) giữa mẫu tế bào được thử nghiệm với phức hệ ACE (RAW264.7+ACE) và mẫu tế bào đối chứng (RAW264.7). Đối với dịng tế bào khơng biểu hiện Dectin-1 là STO, kết quả về số lượng tế bào bị hấp dẫn khơng có sự sai khác (Hình 3.9).
Hình 3.9. Tác dụng hƣớng đích của phức hệ ACE đối với dòng tế bào biểu hiện Dectin-1 (RAW) và không biểu hiện Dectin-01 (STO); *P<0.05
Số lượng tế bào bị hấp dẫn giữa 2 mẫu tế bào được xử lý với phức hệ ACE (RAW26.7+ACE và STO+ACE) là 28.2 lần (P<0.05). Kết quả này cho thấy, phức hệ ACE có khả năng hướng đích rất mạnh mẽ tới dòng tế bào biểu hiện thụ thể Dectin-1 là RAW264.7 nhưng lại khơng có tác động tương tự tới dịng tế bào khơng
RAW264.7 STO
Contr
ol
biểu hiện Dectin-1 là STO. Từ đây có thể kết luận, phức hệ nano ACE có khả năng hướng đích mạnh mẽ tới dịng tế bào biểu hiện mạnh Dectin-1 RAW264.7. Nhằm đánh tìm hiểu kỹ hơn về thành phần tạo nên khả năng hướng đích của phức hệ tới đại thực bào RAW264.7, chúng tơi thực hiện thí nghiệm so sánh phức hệ với các nanogel có thành phần khác nhau cũng như thuốc ETA hịa tan.
3.4.4. Thành phần tạo nên khả năng hướng đích của phức hệ lên dòng
đại thực bào RAW264.7
Quan sát các bề mặt đáy chamber của mẫu được ủ với ACE, AC hay C nanogel ta thấy, các tế bào này được hoạt hóa bởi LPS nên có kích thước thay đổi, lớn hơn tế bào ở trạng thái bình thường, kích thước trung bình của các tế bào đã di cư trong thí nghiệm này là khoảng 16 µm đến 22 µm, các tế bào cũng xuất hiện các tua, khơng giữ được hình dạng trịn như tế bào ở trạng thái ban đầu khi chưa bị kích thích bởi LPS. Ở các mẫu đối chứng, mẫu chứa 1 mg/ml hạt Agarose (A), mẫu chứa thuốc Etanercept (ETA), hồn tồn chỉ thấy các lỗ màng có đường kính 8 µm, gần như khơng thấy sự có mặt của các tế bào, số lượng tế bào đếm được ở các mẫu này đều dưới 200 tế bào/chamber. Điều này cho thấy, ở nồng độ này, các mẫu hạt A và thuốc ETA hồn tồn khơng có khả năng hấp dẫn hoặc cũng có thể nói, các thành phần này khơng có khả năng hướng đích đối với dịng đại thực bào RAW264.7. Khi quan sát và đánh giá mẫu hạt chỉ có thành phần là Agarose, gần như khơng có sự di chuyển xuống bề mặt đáy của chamber. Kết quả này cho thấy dù cũng là một sản phẩm polysaccharide, nhưng với sự khuyết thiếu về liên kết β-glucan, nanogel A hồn tồn khơng có khả năng kích thích đại thực bào RAW264.7 di chuyển về phía mình. Hay nói cách khác, khi khơng có thành phần Curdlan hoặc các liên kết β- Glucan, nanogelhồn tồn khơng có tính hướng đích với dịng đại thực bào RAW264.7.
Đối với mẫu thí nghiệm này, nhóm đã có thể đưa ra kết luận, ở nồng độ 1 mg/ml, sự chênh lệch nồng độ giữa phần dịch thể chứa nanogel trong giếng nuôi cấy và phần dịch nuôi cấy tế bào bên trên không gây ra hiệu ứng làm tế bào di chuyển xuống mặt đáy của chamber. Đối với mẫu thuốc Etanercept, có thể khẳng định rằng, sản phẩm này hồn tồn khơng có tính hướng đích đối với dịng tế bào
miễn dịch biểu hiện mạnh thụ thể Dectin-1 được sử dụng. Việc bao gói sản phẩm thuốc này trong một vật liệu có khả năng hướng đích sẽ làm tập trung liều lượng thuốc tại vị trí ổ viêm nhằm tăng tác dụng của thuốc tại vị trí này cũng như tránh tác dụng phụ của thuốc khi thuốc có mặt ở các vị trí khơng mong muốn. Ở các mẫu có thành phần mang β-glucan là nanogel Curdlan (C), phức hệ mang thuốc ACE và không mang thuốc AC, ta có thể thấy rõ ràng sự hiện diện của rất nhiều tế bào ở phần dưới đáy chamber. Số lượng tế bào đến được lần lượt là trên 104 tế bào/chamber đối với mẫu có C, trên 5x103 tế bào/chamber với các mẫu phức hệ AC và ACE. Khi đối chiếu các kết quả hình ảnh đáy chamber của các mẫu có thành phần là liên kết β-glucan với các mẫu cịn lại, có thể thấy, các mẫu này có khả năng hấp dẫn hay tính hướng đích mạnh đối với dịng đại thực bào RAW264.7 trong điều kiện bị kích thích bởi LPS (Hình 3.10).
Cụ thể, khi so sánh mẫu chứa nanogel Curdlan (C) với mẫu tế bào đối chứng (control) ta có thể thấy rõ được sự chênh lệch về số lượng tế bào di cư xuống bề mặt đáy chamber. Khả năng hấp dẫn đại thực bào của Curdlan thể hiện rõ ở số lượng tế bào di cư về khu vực có chứa thành phần hoạt chất được đưa vào cao gấp hơn 150 lần mẫu đối chứng (Control: không ủ chất) (P< 0.01). Điều này đã cũng phù hợp với quan sát trước đó của và cộng sự khi chỉ ra ái lực cao giữa thụ thể Dectin 1 với beta-1-3 glucan (hay cũng chính là của curdlan) [41]. Khi so sánh mẫu ủ với nanogel mang thuốc (ACE) hay không mang thuốc (AC) ta thấy, số lượng tế bào di cư trung bình cao gấp hơn 60 lần số lượng tế bào di cư ở các mẫu khơng chứa thành phần có curdlan như Agarose (A) và đối chứng (control) (P<0.05). Điểu này chứng tỏ sự có mặt của Curdlan trong thành phần tạo nên khả năng hướng đích cho phức hệ nano.
Hình 3.10. Hình thái tế bào bị hấp dẫn (A) Số lƣợng tế bào bị hấp dẫn (B). *P<0.05, **P<0.01
Như vậy, so với các cơng trình cơng bố về bao gói ETA như của M. Giulbudagian và cs (2018) [18] hay của O. Erdemli và cộng sự (2014) [13], phức hệ agarose-curdlan bao gói etanercept (ACE) của chúng tơi có khả năng hướng đích
chủ động đặc hiệu với nhóm tế bào miễn dịch biểu hiện cao thụ thể Dectin-1. Đây là sự khác biệt lớn tạo nên điểm nhấn của phức hệ bao gói mới này.
Từ kết quả thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu đã đưa ra kết luận, phức hệ nano Agarose- Curdlan mang thuốc ETA ức chế TNF-α có khả năng hướng đích mạnh đối với dịng tế bào biểu hiện Dectin-1 RAW264.7.
3.4.5. Khả năng trung hòa TNF-α của phức hệ
Từ kết quả đánh giá ảnh hưởng của phức hệ tới sinh trưởng của tế bào, nhóm nghiên cứu đã quyết định nồng độ thử nghiệm cho phức hệ mang thuốc (ACE) là 1 mg/ml tương đương với lượng thuốc Etanercept (ETA) được đưa vào là 5 μg/ml. Các thí nghiệm được bố trí với dịng tế bào RAW264.7 được cấy chuyển không quá 10 lần, các mẫu thí nghiệm bao gồm tế bào trong điều kiện khơng hoạt hóa (nontreated) và mẫu tế bào được hoạt hóa với Lipopolysaccharide (LPS) không được xử lý với các sản phẩm nghiên cứu làm đối chứng, mẫu tế bào được hoạt hóa với LPS được xử lý với các mẫu sản phẩm lần lượt là phức hệ không mang thuốc AC với nồng độ 1mg/ml, phức hệ mang thuốc ACE với nồng độ 1 mg/ml, thuốc thương mại Etanercept (ETA) với nồng độ tương ứng được tính theo hiệu suất bao gói là 5 mg/ml.
Từ kết quả thu được cho thấy, trong điều kiện bị hoạt hóa bởi LPS trong 24h, đại thực bào chuột RAW264.7 tiết ra trong thời gian 24h rất cao (khoảng 4523 ± 415.2 pg/ml) trong khi mẫu đối chứng tế bào khơng bị hoạt hóa bới LPS (nontreated) khơng tiết ra TNF-α. Điều này chứng tỏ, trong thí nghiệm này, việc mô phỏng biểu hiện viêm đối với dịng tế bào này hồn tồn thành cơng. Từ đó, tác dụng sinh học của các sản phẩm được đưa và thử nghiệm hoàn toàn là kết quả khách quan và có thể nhận thấy rõ ràng bằng cách đo nồng độ TNF-α bằng phương pháp ELISA.
So sánh với 2 mẫu đối chứng nontreated và LPS, sản phẩn phức hệ nano không mang thuốc AC hồn tồn khơng có khả năng trung hịa TNF-α của tế bào tiết ra trong điều kiện nuôi cấy in vitro mô phỏng viêm bằng cách bổ sung 1 µg/ml LPS vào môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh (Fetal Bovine Serum - FBS). Khi được bổ sung với nồng độ 1 mg/ml của loại phức hệ này trong 24h trong điều kiện tế bào bị hoạt hóa với 1 µg/ml LPS, nồng độ TNF-α gần như khơng thay đổi so với mẫu đối chứng là tế bào bị hoạt hóa bởi LPS và khơng được bổ sung thêm thành phần gì và mơi trường ni cấy (4680 ± 124 pg/ml) (hình 3.11). Như vậy, có thể kết luận rằng, phức hệ khơng mang AC hồn tồn khơng có khả năng trung hịa TNF-α khi thiếu đi thành phần thuốc Etanercept và ở nồng độ 1mg/ml, phức hệ nano hồn tồn khơng ảnh hưởng tới hoạt động sống cũng như sản xuất và bài tiết TNF-α của đại thực bào RAW 264.7 trong thời gian 24 h được bổ sung trực tiếp vào mơi trường cùng với nồng độ 1µg/ml LPS.
Với kết quả thu được khi bổ sung đồng thời phức hệ mang thuốc ACE ở nồng độ 1 mg/ml và LPS ở nồng độ 1µg/ml, ta thấy được, nồng độ TNF-α giảm mạnh khi phức hệ này được bổ sung trong thời gian 24h (405 ± 104 pg/ml) tương đương với thử nghiệm bổ sung thuốc thương mại Etanercept (ETA) ở nồng độ tương ứng là 5 µg/ml (534 ± 257 pg/ml). Kết quả này thấp hơn rất nhiều (khoảng 10 lần) khi so sánh với 2 mẫu đối chứng là phức hệ không mang thuốc AC và mẫu