CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp
2.2.6. Phương pháp đo quang phổ Bradford
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue có trong thành phần của dung dịch Bradford khi tạo phức hợp với protein. Độ hấp thu ở bước sóng 596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn BSA đã biết được nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 h. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế (Spectrophotometer) ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với PBS (Blank). Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị ∆OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành.
Phức hệ được phân tán lại trong dung dịch PBS 1x với nồng độ 100 mg/ml, lắc liên tục với tốc độ 100 vòng/phút, ly tâm với tốc độ 12000 rcf thu dịch tại các thời điểm 3; 10; 24; 48; 72 và 80 giờ. Sau khi thu dịch giải phóng tại mỗi điểm thời gian, các ống chứa phức hệ được bổ sung thêm 1ml PBS 1x (bằng với lượng lấy ra)
và tiếp tục lặp lại quy trình. Dịch thu được sẽ được đo hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford để xác định được nồng độ protein giải phóng theo thời gian. Nồng độ protein có mặt trong dung dịch thu dược được tính dựa trên giá trị OD của đường chuẩn xây dựng bằng cách đo các nồng độ BSA khác nhau. Nồng độ ETA giải phóng ra khỏi phức hệ tại mỗi thời điểm được tính bằng tổng nồng độ ETA đo được tại thời điểm đó với tất cả nồng độ ETA đo được tại thời điểm trước đó.