3.1. Quy trình chế tạo phức hệ và các tính chất lý hóa của phức hệ
3.1.1. Quy trình chế tạo phức hệ
Tối ưu hóa tỉ lệ các thành phần phức hệ
Dựa trên những điều kiện tạo hạt microagarose mang protein của Wang và cộng sự [64, 65],nhóm nghiên cứu đã thay đổi các điều kiện trong quá trình chế tạo phức hệ nano ACE để đạt được kích thước phù hợp. Nhằm đảm bảo khả năng hướng đích, tỉ lệ curdlan có mặt trong phức hệ phải phù hợp. Khả năng hòa tan (1 mg/ml curdlan trong NaOH 0.05M và 3 mg/ml agarose trong nước 60oC) cũng như điều kiện polimer hóa của 2 thành phần agarose và curdlan trong phức hệ cũng khác nhau đòi hỏi nồng độ của 2 thành phần này đảm bảo cho khả năng bao gói của phức hệ. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành tối ưu hóa tỉ lệ 2 thành phần phức hệ bằng cách thay đổi tỉ lệ 2 dung dịch agarose 3 mg/ml và curdlan 1.5 mg/l. Thành phần thể tích của 2 dung dịch này được thay đổi với thể tích 0.8 : 0.2 và 0.6 : 0.4 ml đều cho khả năng phân tán phức hệ rất kém, 1 : 0; 0: 1 ml cho hiệu quả bao gói ETA rất thấp (dưới 30%). Tỷ lệ phù hợp nhất cho bao gói ETA là 0.3 :0.7 ml. Tỉ lệ này tương ứng là 1:1 giữa curdlan và agarose trong 1ml gel nguyên liệu và có thể đạt hiệu suất bao gói tối ưu cũng như khả năng phân tán tốt. Khi kiểm tra với TNF-α thương mại, nhóm nghiên cứu đã đưa ra được lượng ETA được đưa vào phức hệ là 1mg/ml gel (40 µl của ETA 25 mg/ml) là tối đa. Với lượng ETA này, nhóm nghiên cứu kỳ vọng, phức hệ sẽ có cả tác dụng ức chế TNF-α tức thời, vừa có tác dụng này kéo dài theo thời gian hơn so với thuốc ETA tự do có nồng độ tương ứng. Sau quá trình nghiên cứu và thử nghiệm, nhóm nghiên cứu đã đưa ra và chuẩn hóa được quy trình chế tạo phức hệ agarose-curdlan mang thuốc ETA ở dạng nano và bảo quản phức hệ trên bề mặt tinh thể đường D-manitol; quy trình được sơ đồ hố như ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Quy trình chế tạo phức hệ nanogel agarose-curdlan mang thuốc Etanercept
Tối ưu hóa thời gian và cơng suất siêu âm
Để tối ưu hóa quy trình chế tạo, nhóm nghiên cứu đã thay đổi các yếu tố trong quá trình thực hiện phương pháp nhũ tương chuyển đổi huyền phù. Các sản phẩm phức hệ thu được từ việc thay đổi các yếu tố siêu âm khác nhau tạo ra các sản phẩm phức hệ có kích thước và độ đồng nhất khác nhau. Sản phẩm được đánh giá kích thước bằng phương pháp tán xạ ánh sang đơng DLS. Đầu tiên, nhóm nghiên cứu thực hiện các thay đổi về công suất và thời gian thực hiện siêu âm và giữ nguyên thể tích pha dầu là 15 ml (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Kích thƣớc phức hệ Khi thay đổi về thời gian và công suất siêu âm
Công suất Thời gian 60% Kích thước 80% Kích thước 30 giây 299.3 nm 308.9 nm 2 phút 220.5 nm 695.5 nm
Từ các kết quả thí nghiệm thu được, chúng tôi nhận thấy rằng, khi công suất đạt 60% của 750W, phức hệ thu được sẽ đạt kích thước nhỏ nhất, kích thước phức hệ tăng khi tiếp tục tăng cơng suất siêu âm. Thời gian siêu âm cũng có ảnh hưởng tới phức hệ. Mặc dù khơng có nhiều thay đổi về kích thước phức hệ sau khi tăng về thời gian siêu âm, tuy nhiên, khi tăng thời gian siêu âm từ 30 giây lên 2 phút, phức hệ đạt được độ đồng nhất về kích thước. Từ kết quả này, chúng tơi lựa chọn 2 yếu tố về thời gian là 2 phút và công suất là 60% của 750 w để tiếp tục thực hiện các thay đổi khác.
Tối ưu hóa thể tích pha dầu
Nhóm nghiên cứu thực hiện các thay đổi về thể tích paraphin liquid trong khi giữ nguyên các yếu tố về công suất cũng như thời gian thực hiện siêu âm là 60% trong 2 phút và thu được kết quả mong đợi về kích thước phức hệ ACE (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kích thƣớc phức hệ khi thay đổi về thể tích pha dầu trong q trình chế tạo phức hệ Công suất, thời gian Thể tích 60% 2 phút Kích thước 15 ml 220.5 nm 30 ml 56.47 nm
Kích thước trung bình của phức hệ giảm 4 lần (220.5 xuống 56.47) sau khi tăng 2 lần thể tích của pha dầu paraphin liquid (15 ml lên 30 ml). Như vậy, bằng cách tăng thể tích dầu paraphin liquid từ 15 lên 30ml, nhóm nghiên cứu đã thu được phức hệ với kích thước đạt chuẩn kích thước nano.
Để chế tạo được phức hệ dạng nano, chúng tôi nhận thấy cần chú ý đến rất nhiều yếu tố, trong đó có các yếu tố về nhiệt độ, thời gian, công suất nhũ tương chuyển đổi huyền phù và lượng paraphin liquid sử dụng trong pha dầu của quá trình tạo hạt. Về nhiệt độ, nhằm đảm bảo thuốc Etanercept không bị biến tính trong quá
trình chế tạo, nhiệt độ ln được duy trì trong khoảng từ 4 đến 12oC. Về công suất siêu âm: 60% cơng suất của cịi siêu âm 750W được sử dụng nhằm đảm bảo cung cấp đủ năng lượng để đưa hạt về kích thước nano. Về thời gian siêu âm: sau mỗi lần siêu âm 10 giây mẫu sẽ được để lạnh trong 30 giây và tổng thời gian siêu âm kéo dài tới 2 phút nhằm tăng độ đồng nhất của phức hệ. Về thể tích pha dầu, 30 ml paraphin liquid là thể tích thích hợp đủ để thực hiện quy trình nghiền đồng thể đưa phức hệ về kích thước nano.
Quy trình này có thể chế tạo được khoảng 140 đến 150 mg phức hệ dạng bột với D-manitol từ 1 ml gel agarose và curdlan ban đầu. Phức hệ nhanh chóng phân tán vào trong các đệm phân cực như PBS, nước, dung dịch môi trường nuôi cấy DMEM, đệm hepes,… Nhóm nghiên cứu cũng sử dụng quy trình chế tạo này để tạo ra các phức hệ đối chứng khác là phức hệ không mang thuốc (AC), hạt nano Agarose (A), hạt nano Curdlan (C) làm đối chứng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Kích thước của phức hệ
Các hạt quan sát được dưới kính hiển vi điện tử qt (SEM) của phức hệ đa số có kích thước trung bình nằm trong khoảng từ 30 nm đến 100 nm. Điều này hoàn toàn phù hợp với giả thuyết của nhóm về phương pháp chế tạo hạt nano có kích thước nhỏ hơn 100 nm. Hạt có khả năng phân tán trương nở tốt, lấy lại kích thước và khơng bị kết dính từ đó dễ dàng chụp được bằng kính hiển vi điện tử quét SEM ở nồng độ 10 mg/ml (Hình 3.2 A), trong dung dịch đệm PBS 1X pH 7.4.
Hình 3.2. Phức hệ dƣới kính hiển vi điện tử (A) SEM, (B) TEM
Nhằm quan sát rõ hơn hình thái và kích thước của phức hệ, nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp chụp phức hệ dưới kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Hình 3.2 B). Q trình đo và tính tốn kích thước của phức hệ với độ phân giải 105
lần và 2 × 105 lần cho thấy, đa số các hạt thu được có kích thước trung bình nằm trong khoảng từ 35 đến 70 nm.
Kết quả SEM và TEM cho thấy phức hệ có hình cầu hoặc bầu dục, bề mặt nhẵn mịn, kích thước nhỏ dưới 100 nm. Kích thước này khá giống với các kết quả được báo cáo bởi Wang và cộng sự (1997, 1998) [64, 65], hoặc Jing và cộng sự (2016) [30] khi họ tạo hệ nano sử dụng agarose gel. Các hạt tạo thành hoàn tồn đạt u cầu về kích thước của vật liệu mang thuốc dạng nano và sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.3. Phân bố kích thước của phức hệ
Kết quả phân tích tán xạ ánh sáng động (DLS) cho thấy, sau quá trình chế tạo phức hệ, nhóm đã thu được các hạt nano có kích thước khác nhau. Các hạt đạt kích thước nano (<100nm) chiếm 99.8% về số lượng, 63.82% về thể tích và 71.41% về mật độ phân bố. Kết quả cho thấy, mặc dù chưa trải qua quá trình sàng lọc về kích thước nhưng phức hệ lại có độ đồng nhất cao về kích thước (99,8% về số lượng) (Hình 3.3). Nguyên nhân xuất hiện của các hạt lớn hơn kích thước mong muốn có thể là do sự kết dính của các hạt có kích thước nhỏ hơn trong quá trình phân tán phức hệ trở lại trong nước để thực hiện thí nghiệm đánh giá.
Hình 3.3. Phân bố kich thƣớc của phức hệ
A. Phân bố theo mật độ
B. Phân bố theo thể tích
Kết quả này một lần nữa khẳng định phức hệ thu được sau tồn bộ q trình chế tạo có kích thước dạng nano. Với độ đồng nhất cao khi phân tán trong dung dịch nước, khả năng ứng dụng của phức hệ là rất lớn khi được sử dụng như một vật liệu mang thuốc được tiêm dưới da có khả năng mang thuốc và thẩm thấu tốt qua thành mạch.
3.1.4. Các thành phần hóa học của phức hệ
Phức hệ được chuyển hóa từ dạng matrix gel kích thước lớn trở về dạng hạt kích thước nano và kết tinh trên bề mặt tinh thể đường D-manitol phải trải qua nhiều tác động vật lý. Các tác động này có thể gây ra các biết đổi về mặt hóa học khơng mong muốn của phức hệ. Đặc biệt, có thể làm hư hại các liên kết β-glucan, làm mất đi khả năng hướng đích dự kiến của phức hệ. Chính vì vậy, nhằm kiểm tra lại các thành phần tạo thành phức hệ, nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp quang phổ hồng ngoại biến đổi (FT-IR). Với sự giúp đỡ của khoa hóa học, đai học khoa học tự nhiên, nhóm nghiên cứu đã thu được kết quả như sau (Hình 3.4.):
Hình 3.4. Kết quả đo khối phổ hồng ngoại hấp thụ (FTIR) của các mẫu: Đối
A
B
Do phổ FTIR tham chiếu cho ETA khơng có sẵn, nên các cấu hình phổ FTIR riêng biệt của hai thành phần, agarose và curdlan, của phức hợp nanogel ACE đã được phân tích trước tiên để xác nhận sự kết hợp của curdlan vào ma trận agarose của nanogel. Đặc trưng cho các polysaccharide là khả năng hấp thụ phổ hồng ngoại có bước sóng khoảng 3360 cm-1. Các dải hấp thụ năng lượng hồng ngoại của liên kết –OH cho thấy cấu trúc polysaccharide của các thành phần cấu tạo trong phức hệ hoàn toàn nguyên vẹn. Điều này thể hiện rõ ràng hơn khi so sánh giữa Agarose (2924.09), Curdlan (2958.8) và phức hệ ACE (2922) đều cho thấy mức hấp thụ năng lượng ở vị trí liên kết CH. Hơn nữa, gốc C=O cũng như sự có mặt của các liên kết glycosidic được thể hiện ở khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 1641-1649 cm-1 và 1076-1085 cm-1 càng làm sáng tỏ hơn về các cấu trúc polysaccharide có mặt trong phức hệ.
Đặc trưng cho Agarose, một thành phần quan trọng cấu tạo nên phức hệ là cầu liên kết C-O-C thuốc nhóm liên kết 3,6-anhydro-L-galactopyranose được đánh dấu *(Hình 12A) thể hiện rõ ở bước sóng hấp thụ 931.62 cm-1. Đối với Curdlan, liên kết đặc trưng cũng như quan trọng nhất của polymer này khi có mặt trong phức hệ đó chính là liên kết β-Glucan có bước song hấp thụ là 1044cm-1 (Hình 12B). Trong khi đó, sự xuất hiện đồng thời cả 2 loại liên kết này trong mẫu phức hệ nanogel ACE, cho sự toàn vẹn cấu trúc của các thành phần cấu tạo nên phức hệ (Hình 12C).
Điều này chứng tỏ phức hệ nanogel chúng tôi tạo ra mang đầy đủ thành phần agarose và curdlan.
3.2. Khả năng giải phóng thuốc và hiệu suất bao gói của phức hệ
Tỷ lệ phần trăm tích lũy của ETA trong nanogel ACE tỷ lệ thuận với lượng ETA được giải phóng từ nó. Do đó, để ước tính tốc độ giải phóng thuốc và thời gian giải phóng một nửa của thuốc trong phức hệ (half-releasing time), chúng tơi đã tính tốn lượng ETA được giải phóng từ phức hệ gel theo các mốc thời gian từ 0 đến 80 h (0, 24, 48, 72 và 80 h). Nồng độ của protein được giải phóng (µg/mL) trong các mốc thời gian cụ thể được định lượng bằng Bradford. Hình 5 cho thấy việc giải phóng ETA từ phức hệ ACE tuân theo phương trình tuyến tính: y = 0,9714x - 2,5056 với R² = 0,99253. Do nồng độ của ETA được đóng gói ở thời điểm cuối cùng (80 giờ) là 738.83 ± 90.61 µg/ mL và lượng đầu vào ban đầu của ETA là 1 mg/mL, hiệu suất bao gói của phức hệ được tính trung bình là 73.88 ± 9.0%.
Hình 3.5. Khả năng giải phóng ETA ra khỏi phức hệ ACE theo thời gian
% ETA được giải phóng ra khỏi phức hệ vào dung dich PBS pH 7.4 trong thời gian từ 0 đến 80 giờ. Kết quả trên hình là trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm ± SD
Hiệu suất bao gói được tạo thành từ quy trình của nhóm nghiên cứu cao tương đương với một số sản phẩm bao gói thuốc khác đã được cơng bố, ví dụ như: insulin được bao gói trong phức hệ micro PLGA-agarose (74.6 9.11% đến 88.6 10%) [64]; PCL microspheres bao gói Etanercept (65.06 1.85*) [13]; phức hệ micro MPEG-PCL-MPEG bao gói Etanercpet (75.64 1.78*) (* p 0.01) [71]; phức hệ nano bao gói Bovine serum albumin (BSA) được chế tạo từ N-(2-hydroxyl) propyl-3-trimethylammonium chitosan chloride (HTCC) với tripolyphosphate (90%) [66].
Dựa trên dữ liệu được trình bày trong Hình 3.5, chúng tơi cũng có thể tính tốn thời gian giải phóng 50% ETA từ nanogel ACE là khoảng 52 giờ. Khoảng thời gian giải phóng một nửa lượng thuốc của phức hệ ACE lớn hơn nhiều so với hệ thống mang thuốc berbamin trong hệ micro chitosan agarose (khoảng 12 h) của Hu và cộng sự [23] và Fluorouracil hay Theophylline được bao gói hệ thống micro ALG của Liu và cộng sự [33] (12 phút và 12-17 phút). Với tốc độ giải phóng này, ACE có thể đảm bảo ngăn chặn các điều kiện môi trường ngoại bào gây ảnh hưởng đến chức năng của thuốc ETA được bao gói. Nhờ vậy, ETA có mặt trong phức hệ ACE sẽ có thời gian hoạt động dài hơn so với ETA tự do dạng hòa tan.
y = 0.9769x - 2.3434 R² = 0.9931 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 L ƣợn g E tanerc ept đƣ ợc gi ải ph óng từ ph ức hệ (% )
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với mục tiêu của nhóm nghiên cứu khi hướng tới chế tạo một hệ mang thuốc giải phóng chậm nhằm ứng dụng điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp.
3.3. Khả năng phân tán của phức hệ
Vấn đề thường gặp phải ở các vật liệu nano đặc biệt là ở các vật liệu có thành phần là các polymer tự nhiên là nguy cơ kết dính lại của các hạt sau khi loại bỏ các thành phần chất ổn định, nhũ hóa và làm giảm độ nhớt của dung môi. Sau khi loại bỏ các thành phần dầu paraphin liquid là một dung mơi khơng phân cực có độ nhớt cao cũng như span 80 là một chất ổn định, phức hệ mang thuốc ACE hồn tồn có thể kết dính trở lại với nhau để tạo thành các khối gel có kích thước lớn, khơng có khả năng vận chuyển thuốc như mong đợi. Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu đã tiến hành tìm hiểu khả năng phân tán của phức hệ trong đệm phân cực PBS 1X pH 7.4 nhằm đánh giá nguy cơ kết dính của phức hệ trong các điều kiện nồng độ khác nhau. Sử dụng nhiệt độ 37oC nhằm mô phỏng điều kiện trong các mơ hình thực nghiệm sinh học (Hình 3.6) Khối lượng phức hệ ACE 1mg 2mg 4mg 10mg 15mg 20mg Phức hệ dạng khô 3 giờ, nhiệt độ 37oC 24 giờ, nhiệt độ 37oC
Ta thấy, trong thời gian 3 giờ phân tán trong dung dịch PBS 1x, pH7.4, quan sát bằng mắt thường có thể thấy các khối gel kết dích lại ở các ống có nồng độ phức hệ là 15 và 20 mg/ml. Sau khi tiếp tục ủ các ống nghiệm này trong cùng điều kiện nhiệt độ, có thể thấy ở 3 ống dịch có nồng độ phức hệ cao là 10 mg/ml, 15 mg/ml và 20 mg/ml xuất hiện rất nhiều hạt gel kết dính. Hiện tượng kết dính gel có thể gây nhiễu các thí nghiệm về đặc tính hóa lý của phức hệ cũng như gây ảnh hưởng đến quá trình thử nghiệm trên tế bào. Vì vậy, để loại bỏ hiện tượng này nhóm thí nghiệm sẽ sử dụng ởnồng độ dưới 4 mg/ml cho các thí nghiệm tiếp theo.