CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp
2.2.9. Phương pháp đánh giá độc tính tế bào sử dụng kit CCK-8
Chất chỉ thị màu formazan đã được sử dụng để đánh giá số lượng tế bào có độ tin cậy cao. Kit CCK-8 có chứa muối tetrazolium-8 (WTS-8) nằm trong nhóm các muối water-soluble tetrazolium salts (WTSs) tạo ra sản phẩm là formazan có màu dễ phát hiện sau khi khử NADH có trong tế bào, là một loại thuốc thử được sử
dụng rộng rãi trong các thí nghiệm về tăng sinh tế bào cũng như thử nghiệm về độc tính. Đặc điểm của các loại thuốc thử WTSs là dễ tan trong nước và bị khử ở bên ngồi tế bào, chính vì vậy chỉ cần qua một bước ủ là có thể đo được kết quả ngay, không cần quan các bước phá hủy tế bào và hịa tan, chính vì vậy phương pháp này sẽ thuận lợi hơn các phương pháp MTT, XTT. WTS-8 phù hợp với đa số các dòng tế bào và cho kết quả tương tự hoặc tốt hơn, dễ thực hiện, dễ thao tác hơn các thuốc thử về tăng sinh tế bào và độc tính khác (Hình 2.4) [45].
Hình 2.4. Phản ứng của WTS-8 trong kit CCK-8 (Sigma) với tế bào sống [45]
Với sự có mặt của xúc tác 1-Methoxy PMS và một electron trung gian, WTS-8 đã bị khử bởi NADH tạo thành WTS-8 Formazan có màu da cam hấp thụ ánh sáng có bước sóng 460 nm. Việc chuyển đổi từ dạng oxi hóa NAD+
thành dạng khử NADH và ngược lại tạo ra cơ chế cho và nhận electron của tế bào. NAD+ và NADH đóng một vai trị rất quan trọng đến phản ứng liên quan đến q trình đường phân, oxi hóa, phosphorine hóa và lên men. Với tầm quan trọng của NADH đối với một tế bào, sự hiện diện của phân tử này được coi như là một chỉ thị cho tế bào sống. Hàm lượng formazan tạo thành sẽ có tỷ lệ tương ứng với nồng độ NADH tạo thành cũng như số lượng tế bào sống trong vùng nuôi cấy thử nghiệm [24, 45].
Tế bào RAW264.7 (20 ×103 tế bào/giếng) được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng trong vịng 16 giờ. Tiếp đó, tế bào được ủ với các phức hệ nano-ACE và phức hệ nano-AC (0; 0,5; 1; 2 và 4 mg/ml) tương đương với nồng độ ETA (0; 2,5; 5; 10 và
giếng môi trường nuôi cấy các mẫu và ủ trong 1 h. Phản ứng xảy ra sẽ biến đổi màu môi trường trong các giếng từ màu đỏ của môi trường thành màu da cam đặc trưng của formazan hòa tan. Sau đó, mẫu được đo độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 450 nm bằng máy so màu ELISA (Biorad).
Dựa trên giá trị OD thu được, vẽ đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng và tính được giá trị IC50 của từng loại thuốc, từ đó chọn ra nồng độ phù hợp để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.