tinh sạch của lectin hạt Đậu ma
Dịch chiết lectin hạt Đậu ma sau q trình tinh sạch có hoạt độ riêng tăng lên, hoạt tính gây ngƣng kết hồng cầu cao do vậy có thể thấy độ sạch của lectin tỷ lệ thuận với hoạt tính của nó. Tuy vậy hoạt tính gây ngƣng kết vi khuẩn của lectin thì chƣa thể đánh giá đƣợc. Để tìm hiểu và so sánh khả năng gây ngƣng kết vi khuẩn giữa dịch chiết lectin thô và lectin đã tinh sạch, tiến hành phản ứng ngƣng kết vi khuẩn của dịch chiết thô và chế phẩm lectin hạt Đậu ma với bốn loài vi khuẩn. Kết quả thực nghiệm đƣợc trình bày trên Bảng 3.17.
Bảng 3.17. Khả năng ngƣng kết vi khuẩn của dịch thô và chế phẩm hạt Đậu ma
Lectin
Mức độ ngƣng kết
Salmonella Shigella E. coli S. aureus
Dịch chiết thô - - + -
Chế phẩm - - ++ -
Chú thích: +: ngưng kết yếu (đường kính cụm ngưng kết < 0,2 cm; ++: ngưng kết trung bình (đường kính cụm ngưng kết từ 0,2 - 0,5 cm); (-): không gây ngưng kết
Bảng 3.17 cho thấy cả dịch chiết thô và chế phẩm lectin hạt Đậu ma đều chỉ ngƣng kết với E. coli mà không ngƣng kết với 3 vi khuẩn cịn lại, tuy nhiên mức độ ngƣng kết có sự khác biệt. Ở mẫu lectin Đậu ma thô, khả năng gây ngƣng kết với vi khuẩn E. coli ở với mức độ thấp (+), còn chế phẩm sau tinh sạch có mức độ gây
ngƣng cao hơn (++). Điều này cho thấy mặc dù hàm lƣợng protein trong dịch chiết thô cao gấp 111 lần so với chế phẩm nhƣng lại chứa rất nhiều protein tạp, trong khi đó chế phẩm có hàm lƣợng protein thấp hơn nhƣng các protein này chủ yếu là lectin do vậy hoạt tính gây ngƣng kết với vi khuẩn của chế phẩm sẽ cao hơn.
3.4.2. Lectin từ cây Tú cầu đỏ
3.4.2.1. Sắc kí qua cột trao đổi ion DE-52 Cellulose
Thu dịch chiết lectin thô của cây Tú cầu đỏ bằng cách nghiền mẫu trong đệm Tris-HCl 20 mM pH 8,3 với tỉ lệ 1/10, khuấy từ 2h ở 40C, ly tâm 12 000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút.
Cho 10 ml dịch chiết lectin thô lên cột sắc ký trao đổi ion DE-52 Cellulose. Phần lectin không gắn trên cột đƣợc rửa ra bằng đệm PB 0,02 M pH 7,4 với tốc độ 15 ml/h. Phần lectin gắn trên cột đƣợc đẩy ra bằng gradient nồng độ NaCl từ 0 – 1 M trong đệm glycin 0,05 M, pH 2,6 với tốc độ chảy 15 ml/h, tiến hành thu các phân đoạn. Kết quả cho thấy sau q trình sắc kí đã thu đƣợc 29 phân đoạn, mỗi phân đoạn 3 ml.
Sau đó từng phân đoạn thu nhận đã đƣợc kiểm tra hoạt tính ngƣng kết hồng cầu ngƣời và đo hàm lƣợng protein. Kết quả tinh chế lectin thân hành cây Tú cầu đỏ đƣợc thể hiện Hình 3.19.
Kết quả tại Hình 3.19 cho thấy dịch chiết thơ Tú cầu đỏ sau khi đƣợc sắc ký qua cột DE - 52 Celulose cho 3 đỉnh có hàm lƣợng protein cao nhất, trong đó đỉnh P có hàm lƣợng protein cao nhƣng hoạt độ lectin lại thấp. Hai đỉnh L1 và L2 vừa có hàm lƣợng protein cao vừa có hoạt độ lectin cao, trong đó đỉnh L1 có hoạt độ lectin cao hơn nên đƣợc chọn làm đỉnh lectin chính và đƣợc gọi là chế phẩm Tú cầu đỏ 1. Chế phẩm này sau đó đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng phƣơng pháp điện di biến tính (SDS-PAGE).
Hình 3.19. Sắc kí đồ cột DE - 52 Cellulose của dịch chiết thơ Tú cầu đỏ
Chú thích: Kích thước cột 1,5 cm x 20 cm, thể tích lên cột 10 ml, đệm gắn Tris - HCl 0,02 M- pH 8.3, phản hấp phụ bằng gradient
NaCl 0 – 1 M, tốc độ chảy 15 ml/ h, thể tích mỗi phân đoạn 3 ml.
3.4.2.2. Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm bằng điện di biến tính
Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lƣợng bằng phƣơng pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamide (SDS- PAGE) của mẫu chế phẩm lectin Tú cầu đỏ thu đƣợc sau khi sắc ký thể hiện trên Hình 3.20.
Hình 3.20 cho thấy mẫu lectin Tú cầu đỏ thơ (giếng 2) có rất nhiều băng polypeptide trong khi chế phẩm lectin Tú cầu đỏ (giếng 1) chỉ xuất hiện một băng đậm có kích thƣớc khoảng 26 kDa. Nghiên cứu của nhiều tác giả khác về lectin thực vật cũng cho thấy những kết quả tƣơng đƣơng về khối lƣợng phân tử tƣơng đối nhỏ của các lectin thu đƣợc nhƣ lectin từ Sambucus nigra là 31-33 kDa, lectin từ tảo Vidalia obtusibila là 38 kDa [56]. Nhƣ vậy đây chính là chế phẩm lectin đã đƣợc
Hình 3.20. Ảnh kết quả điện di SDS – PAGE của lectin Tú cầu đỏ
Chú thích: M – Các protein chuẩn có khối lượng phân tử là 25, 37, 50, 75, 100 kDa (Fermentas)
1 – chế phẩm lectin sau sắc ký; 2 - Dịch chiết lectin thô
Kết quả phân tích độ tinh sạch của lectin Tú cầu đỏ sau khi tinh chế bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion qua cột DE- 52 Cellulose đƣợc trình bày tại Bảng 3.18.
Bảng 3.18. Kết quả tinh chế lectin Tú cầu đỏ qua cột DE – 52 Cellulose
Phân đoạn Thể tích (ml) Protein Hoạt độ Protein tổng số (mg) Hiệu suất (%) Hoạt độ tổng số (HAA x 103) Hoạt độ riêng (HAA x 103 /mg) Hiệu suất (%) Độ tinh sạch DCT 10 102,1 100 1024 10,03 100 1 TC -CP 9 6,55 6,4 230,4 35,2 22,5 3,41
Kết quả phân tích về hàm lƣợng protein và hoạt độ của lectin TC-CP cho thấy lectin này đƣợc đẩy ra ở nồng độ muối 0,25 - 0,4 M, có hiệu suất thu hồi là 22,5% và độ tinh sạch tăng gấp 3,4 so với dịch lectin thô ban đầu.
3.4.2.3. Nghiên cứu một số đặc tính hóa sinh miễn dịch của lectin Tú cầu đỏ
- Ảnh hưởng của pH
Chế phẩm lectin đƣợc xử lý trong đệm PBS và Tris – HCl với pH thay đổi từ 7,0 - 9,0, sau đó xác định hoạt độ của lectin bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên Hình 3.21.
Hình 3.21. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của chế phẩm lectin Tú cầu đỏ
Chú thích: HAA- đơn vị hoạt độ ngưng kết hồng cầu.
Kết quả thu đƣợc cho thấy chế phẩm lectin Tú cầu đỏ hoạt động mạnh và ổn định trong vùng pH kiềm (8,0- 9,0).
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ cũng là yếu tố ảnh hƣởng mạnh đến hoạt tính của lectin. Tƣơng tự nhƣ với lectin Đậu ma, tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với dịch chiết lectin Tú cầu đỏ. Kết quả đƣợc thể hiện trên hành 3.22.
Hình 3.22. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ chế phẩm lectin Tú cầu đỏ
Chú thích: HAA- đơn vị hoạt độ ngưng kết hồng cầu
Hình 3.22 cho thấy chế phẩm lectin từ Tú cầu đỏ đạt hoạt độ cao nhất ở nhiệt độ 40C - 300C, ở 700C hoạt tính lectin duy trì trong 2 giờ, và mất hồn tồn hoạt tính sau 30 phút ở các nhiệt độ cao hơn (80 - 1000
C).
Về đặc tính bền nhiệt của chế phẩm lectin Tú cầu đỏ cho thấy ở nhiệt độ 4 - 300C, hoạt độ của chế phẩm vẫn đạt đƣợc giá trị cao trong 48, tuy nhiên sau 72 giờ thì hoạt tính giảm mạnh (50 %). Ở các nhiệt độ cao hơn (400C, hoạt độ của lectin giảm nhanh chỉ sau 24 giờ và sau 72 giờ hoạt tính này còn rất thấp (giảm mạnh khoảng 80%) . Kết quả này cho thấy lectin thân hành Tú cầu đỏ khá bền nhiệt và có thể đƣợc bảo quản tốt nhất ở 4 - 300C trong 48 giờ.