20
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Bộ môn nghiên cứu Ký sinh Trùng, Phân viện Thú y miền Trung. Giải trình tự gen tại Cơng ty Marogen Inc, Hàn Quốc.
Thu thập mẫu tại một số địa điểm ở huyện Tuy Phƣớc và An Nhơn, tỉnh Bình Định.
Thời gian nghiên cứu
Đề tài thực hiện từ tháng 9/2014 – tháng 10/2015
2.2 NGUYÊN, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Các loại mẫu vật: mẫu sán lá gan nhỏ ký sinh trong gan và túi mật tại huyện Tuy Phƣớc và An Nhơn, tỉnh Bình Định.
Các loại hóa chất:
Hóa chất nhuộm carmin: Carmine Red (Sigma), axít acetic 100% (Merck), cồn ethanol, formaldehyde 37%, axít hydrochloric, xylene (Merck).
Hóa chất làm phân tử: DNA marker 100 bp (Promega), dNTP (QIAGEN), Loading dye (QIAGEN), PCR buffer (QIAGEN), TBE buffer (QIAGEN), DNA polymerase (QIAGEN), Ethanol pure, bộ kít chiết tách DNA tổng số (DNeasy Tissue Kit, QIAGEN), bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR (QIAGEN), PCR master mix (Promega), TBE 10X, Agarose (Invitrogen), Ethidium bromide (Invitrogen); muối (NaCl), cồn etylic, nƣớc cất, nƣớc muối sinh lý.
Một số hóa chất cần thiết khác để nghiên cứu ký sinh trùng và sinh học phân tử. Máy móc, thiết bị: Máy đo nồng độ DNA (BioDrop – UK), máy PCR
Mastercycler pro S (Eppendorf, Đức)(GeneAmp PCR system 9700 AB), máy đọc và chụp ảnh gel GelDoc (Biorad, Mỹ), bộ điện di sản phẩm PCR ngang Midigel XL (Apelex, Pháp), Bộ điện di nhỏ MGU – 102T (CBS Scientific Co, Mỹ), máy ly tâm lạnh VSAID Centrifuge 5415R (Eppendorf, Đức), Vortex MS3 (IKA, Đức), bể điều nhiệt cách thủy NB301L (N-BIOTEK, Hàn Quốc), Cân điện tử Adventurer Pro (Ohaus, Mỹ), Tủ lạnh SR-20KN (Sanyo, Nhật
21
Bản), lị vi sóng. Kính hiển vi soi nổi, kính lúp, kính hiển vi có gắn Micrometer thị kính, lá kính, phiến kính, ống eppendorf, micropipet, pipet tip, bộ đồ mổ gia súc, ống hút nhựa, hộp lồng, chai thủy tinh nút vặn, chai thủy tinh nút mài, cốc thủy tinh chia vạch,...
2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phƣơng pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên vịt
Phƣơng pháp chọn mẫu: chọn mẫu ngẫu nhiên đơn.
Tiến hành mổ khám vịt để xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ. Các chỉ tiêu khảo sát:
Giống vịt: vịt siêu trứng (giống vịt triết giang và khakicampbell); vịt siêu thịt (giống vịt CV Supper M và vịt Bắc Kinh ).
Nhóm tuổi: vịt con (0-8 tuần tuổi); vịt hậu bị (8-24 tuần tuổi); vịt sinh sản (trên 24 tuần tuổi).
Hình thức ni: ni nhốt và ni chăn thả.
Tính dung lƣợng mẫu tối thiểu bằng phần mềm WinEpicope 2.0. So sánh sai khác bằng phần mềm Epicalc 2000 (Shift + F10/compare). - Tỷ lệ nhiễm chung (%)
ố ẫ ễ
ố ẫ ể
- Tỷ lệ nhiễm theo lứa tuổi (%)
ố ẫ ễ ừ ứ ổ
ố ẫ ể ù ứ ổ
- Tỷ lệ nhiễm theo phƣơng thức chăn nuôi (%)
ố ẫ ễ ừ ƣơ ứ
ố ẫ ể ù ƣơ ứ
Cách thu thập, tính số lƣợng: Dùng kim giải phẩu hoặc bút lông lấy sán cho vào
đĩa petri và đếm số lƣợng có trong đĩa.
Bảo quản mẫu: rửa sán với nƣớc muối sinh lý, bảo quản trong cồn 70o hoặc - 20oC để nghiên cứu cấu trúc phân tử.
22
Nội dung viết trên nhãn: địa điểm thu mẫu, tên động vật, sơ bộ phân loại, vị trí ký sinh, thời gian,…
Nội dung viết trên sổ: số thứ tự, thời gian mổ khám, tên loài động vật, lứa tuổi, địa điểm, những biến đổi bệnh lý của vị trí ký sinh, số lƣợng sán, mơ tả đặc điểm hình thái, sơ bộ phân loại,…
2.3.2 Phƣơng pháp định danh lồi
Tóm tắt các bƣớc định danh lồi nhƣ sau
Rửa mẫu bằng nƣớc muối sinh lý
Mơ tả hình thái cấu tạo
Chuỗi nucleotit thu nhận So sánh trình tự nucleotit bằng phần mềm BioEdit Tìm kiếm, so sánh trình tự tƣơng đồng bằng chƣơng trình Blast Tạo cây phả hệ bằng phần mềm Mega
Định lồi bằng hình thái học Định loài bằng kỹ thuật phân tử
Nhuộm carmine
Chiết tách DNA tổng số
Thực hiện phản ứng PCR
Giải trình tự gen COI Bảo quản mẫu trong cồn 700
Bảo quản mẫu trong cồn 700
hoặc - 200C
23
2.3.2.1.Phƣơng pháp nghiên cứu hình thái học Pha thuốc nhuộm:
Dung dịch AFA Formaldehyde 37% 10 ml
Ethanol 95% 5 ml
Axít acetic 2 ml
Nƣớc cất 40 ml
Semichon’s carmine Axít acetic 50 ml
Nƣớc cất 50 ml
Carmine Pha bảo hòa
Cho Semichon’s carmine vào lị vi sóng, nhiệt độ 90 oC trong 15 phút. Sau đó lọc hỗn dịch qua giấy lọc để loại bỏ chất cặn của thuốc nhuộm.
Dung dịch tẩy màu Axít hydrochloric 1 ml
Ethanol 70% 100 ml
Kỹ thuật nhuộm sán trƣởng thành (Semichon’s acetic carmine 1929) 1. Ngâm mẫu sán vào dung dịch AFA, để qua đêm.
2. Lấy sán cho vào cồn 70%, thời gian 30 phút.
3. Cho mẫu sán vào đĩa petri, ngâm với dung dịch Semichon’s carmine, thời gian 60 phút.
4. Rửa mẫu sán với cồn 70% trong 30 phút
5. Ngâm sán trong dung dịch tẩy màu. Mỗi lần 5 phút, lặp lại cho đến khi sán chuyển sang màu hồng.
6. Làm khô nƣớc từ mẫu sán với nồng độ cồn từ thấp tới cao (70%; 80% và cồn tuyệt đối), thời gian mỗi lần 30 phút.
7. Cuối cùng, mẫu sán đƣợc ngâm trong dung dịch xylene 1 phút để làm trong suốt. Lấy sán ra, thấm khơ, đặt lên phiến kính và gắn lamen có dán keo canada. Soi mẫu dƣới kính hiển vi để phân loại.
24
Phân loại
Tổng số 50 mẫu sán trƣởng thành thu thập trên vịt ở Bình Định đƣợc phân loại dựa theo khóa phân loại sán lá “Trematoda” (David et al., 2008). Bao gồm hình thái, vị trí các cơ quan tổ chức: giác miệng, giác bụng, hầu, thực quản, manh tràng, tử cung, tinh hoàn, tuyến nỗn hồng, hệ thống bài tiết.