16
Bình Định là tỉnh duyên hải miền Trung Việt Nam. Lãnh thổ của tỉnh trải dài 110 km theo hƣớng Bắc-Nam, diện tích tự nhiên: 6.025 km², diện tích vùng lãnh hải: 36.000 km². Phía Bắc giáp tỉnh Quảng Ngãi, điểm cực Bắc có tọa độ: 14°42'10 Bắc, 108°55'4 Đông. Phía Nam giáp tỉnh Phú Yên, điểm cực Nam có tọa độ: 13°39'10 Bắc, 108°54'00 Đông. Phía Tây giáp tỉnh Gia Lai, điểm cực Tây có tọa độ: 14°27' Bắc, 108°27' Đông. Phía Đông giáp biển Đông với bờ biển dài 134 km, điểm cực Đông là xã Nhơn Châu (Cù Lao Xanh) thuộc thành phố Quy Nhơn, có tọa độ: 13°36'33 Bắc, 109°21' Đông. Bình Định đƣợc đánh giá là có vị trí chiến lƣợc hết sức quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội của vùng kinh tế trọng điểm miền Trung, đƣợc xem là một trong những cửa ngõ ra biển của các tỉnh Tây Nguyên và vùng nam Lào, đông bắc Campuchia.
Địa hình của tỉnh tƣơng đối phức tạp, thấp dần từ Tây sang Đông, với độ chênh lệch khá lớn (khoảng 1.000m). Các dạng địa hình phổ biến là:
Vùng núi, đồi và cao nguyên: chiếm 70% diện tích toàn tỉnh với độ cao trung bình 500 - 1.000m, đỉnh cao nhất là 1.202m ở xã An Toàn (huyện An Lão). Các dãy núi chạy theo hƣớng Bắc - Nam, có sƣờn dốc đứng. Nhiều khu vực núi ăn ra sát biển tạo thành các mỏm núi đá dọc theo bờ, vách núi dốc đứng và dƣới chân là các dải cát hẹp. Đặc tính này đã làm cho địa hình ven biển trở thành một hệ thống các dãy núi thấp xen lẫn với các cồn cát và đầm phá.
Vùng đồi: tiếp giáp giữa miền núi phía tây và đồng bằng phía đông, có diện tích khoảng 159.276 ha, có độ cao dƣới 100m, độ dốc tƣơng đối lớn từ 10° – 15°.
Vùng đồng bằng: Diện tích khoảng 1.000 km², đƣợc tạo thành do các yếu tố địa hình và khí hậu, thƣờng nằm trên lƣu vực của các con sông hoặc ven biển và đƣợc ngăn cách với biển bởi các đầm phá, các đồi cát hay các dãy núi.
Vùng ven biển: Bao gồm các cồn cát, đụn cát tạo thành một dãy hẹp chạy dọc ven biển với hình dạng và quy mô biến đổi theo thời gian.
Bình Định còn có 33 đảo lớn nhỏ đƣợc chia thành 10 cụm đảo hoặc đảo đơn lẻ, trong đó đảo Nhơn Châu là đảo lớn nhất (364 ha) cách thành phố Quy Nhơn 24 km, có trên 2.000 dân. Ngoài các vùng địa hình đặc trƣng nói trên, Bình Định có khá nhiều sông. Các sông ngòi không lớn, độ dốc cao, ngắn, hàm lƣợng phù sa thấp, tổng trữ lƣợng nƣớc 5.2 tỷ m³, tiềm năng thuỷ điện 182,4 triệu kw. Có 4 sông lớn là: Lại Giang, Kôn, La Tinh và Hà Thanh. Nhiều hồ nhân tạo đƣợc xây dựng để phục vụ cho việc
17
phát triển nông nghiệp và nuôi trồng thủy hải sản. Đặc biệt, đầm Thị Nại là đầm lớn, rất thuận lợi cho việc phát triển cảng biển tầm cỡ quốc gia và góp phần phát triển khu kinh tế Nhơn Hội. Đầm còn đƣợc biết đến là một di tích lịch sử - văn hóa và với cây cầu vƣợt biển dài nhất Việt Nam hiện nay.
Bình Định có tính chất nhiệt đới ẩm, gió mùa. Nhiệt độ không khí trung bình năm: ở khu vực miền núi biến đổi 20,1 – 26,1°C; tại vùng duyên hải là 27°C. Độ ẩm tuyệt đối trung bình tháng trong năm: tại khu vực miền núi là 22,5 – 27,9% và độ ẩm tƣơng đối 79 – 92%; tại vùng duyên hải độ ẩm tuyệt đối trung bình là 27,9% và độ ẩm tƣơng đối 79%. Tổng lƣợng mƣa trung bình năm là 1751mm, cực đại là 2658mm, cực tiểu là 1131mm. Mùa mƣa bắt đầu từ tháng 09 – 12, mùa khô kéo dài từ tháng 01– 08. Cấu tạo địa chất, địa hình, khí hậu làm cho Bình Định tuy không có đồng bằng rộng lớn nhƣng có đồng ruộng phì nhiêu, đa dạng về sản phẩm nông, lâm, ngƣ…, nhiều tài nguyên khoáng sản và tiềm năng thuỷ điện.
1.4.2 Điều kiện kinh tế - xã hội
Bình Định có nhiều dân tộc chung sống, đoàn kết trong đấu tranh và xây dựng đất nƣớc. Dân tộc Kinh chiếm 98% so tổng dân số, 3 dân tộc thiểu số chiếm khoảng 2% chủ yếu là Ba Na, H're, Chăm ở 113 làng/22 xã các huyện miền núi, trung du. Dân số tỉnh đang có xu hƣớng giảm cơ học, theo kết quả điều tra chính thức ngày 01/4/2009, dân số tỉnh Bình Định có 1.485.943 ngƣời, trong thành thị chiếm 25%, nông thôn chiếm 75%, mật độ 247 ngƣời/km².
Với tổng dân số 1.489.700 ngƣời (năm 2010) phân bố không đều, trong đó thành phố Quy Nhơn cao nhất là 983 ngƣời/km2
, thấp nhất là huyện Vân Canh 30,9 ngƣời/ km2. Dân số nam chiếm 48,7%, nữ chiếm 51,3%; dân số thành thị chiếm 27,7% dân số, nông thôn chiếm 72,3%. Cơ cấu dân số trẻ, dƣới 30 tuổi chiếm 62,8% là nguồn cung cấp lao động dồi dào cho các ngành kinh tế. Hiện có 832.600 lao động đang làm việc trong các ngành kinh tế quốc dân.
Hệ thống giao thông khá đồng bộ. Quốc lộ 1A (qua tỉnh 118 km) và đƣờng sắt quốc gia (qua tỉnh 150 km) chạy xuyên suốt chiều dài Bắc - Nam của tỉnh; cùng với Quốc lộ 1D (dài 34 km), Quốc lộ 19 (qua tỉnh 70 km) nối Cảng Quy Nhơn với bên ngoài thuận lợi. Cảng Quy Nhơn là một trong 10 cảng biển lớn của cả nƣớc có thể đón tàu 3 vạn tấn ra vào cảng an toàn. Cảng Thị Nại là cảng địa phƣơng đang đƣợc nâng
18
cấp đón tàu 1 vạn tấn. Sân bay Phù Cát cách thành phố Quy Nhơn 30km về phía Bắc đã và đang mở thêm nhiều chuyến bay đón hành khách đi và đến Bình Định.
Trong những năm qua, kinh tế - xã hội tỉnh Bình Định không ngừng phát triển. Các lĩnh vực giáo dục, y tế, văn hoá, xã hội đƣợc nâng cao, các công trình hạ tầng kỹ thuật và phúc lợi xã hội đƣợc đầu tƣ phát triển.
Mặc dù chịu ảnh hƣởng của tình hình suy thoái kinh tế thế giới nhƣng kinh tế thời kỳ 2006 - 2010 của tỉnh liên tục tăng, năm sau cao hơn năm trƣớc. Tổng sản phẩm địa phƣơng (GDP) tăng bình quân 10,7%/năm. Trong đó các ngành thuộc khu vực công nghiệp - xây dựng 15,2%, nông - lâm - ngƣ nghiệp tăng 7,1% và dịch vụ tăng 11,2%. Giá trị sản xuất công nghiệp tăng bình quân 15,7%/năm. GDP bình quân/ngƣời tăng từ 219,7 USD năm 2000 lên 401 USD năm 2005 và 901 USD vào năm 2010. Cơ cấu kinh tế chuyển dịch theo hƣớng tích cực, năm 2000 có cơ cấu nông, lâm, ngƣ nghiệp - công nghiệp, xây dựng - dịch vụ là 42,2% - 22,8% - 35%, đến năm 2005 có tỷ trọng tƣơng ứng là 38,4% - 26,7% - 34,9% và năm 2010 là: 35% - 27,4% - 37,6%. Nhìn chung, công nghiệp có bƣớc phát triển khá, nhiều khu, cụm công nghiệp đƣợc hình thành, khu kinh tế Nhơn Hội đang đƣợc xây dựng hạ tầng và xúc tiến thu hút đầu tƣ. Sản xuất nông nghiệp phát triển khá toàn diện theo hƣớng sản xuất hàng hóa.
19
Hình 1.6: Bản đồ hành chính tỉnh Bình Định.
20
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Bộ môn nghiên cứu Ký sinh Trùng, Phân viện Thú y miền Trung. Giải trình tự gen tại Công ty Marogen Inc, Hàn Quốc.
Thu thập mẫu tại một số địa điểm ở huyện Tuy Phƣớc và An Nhơn, tỉnh Bình Định.
Thời gian nghiên cứu
Đề tài thực hiện từ tháng 9/2014 – tháng 10/2015
2.2 NGUYÊN, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Các loại mẫu vật: mẫu sán lá gan nhỏ ký sinh trong gan và túi mật tại huyện Tuy Phƣớc và An Nhơn, tỉnh Bình Định.
Các loại hóa chất:
Hóa chất nhuộm carmin: Carmine Red (Sigma), axít acetic 100% (Merck), cồn ethanol, formaldehyde 37%, axít hydrochloric, xylene (Merck).
Hóa chất làm phân tử: DNA marker 100 bp (Promega), dNTP (QIAGEN), Loading dye (QIAGEN), PCR buffer (QIAGEN), TBE buffer (QIAGEN), DNA polymerase (QIAGEN), Ethanol pure, bộ kít chiết tách DNA tổng số (DNeasy Tissue Kit, QIAGEN), bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR (QIAGEN), PCR master mix (Promega), TBE 10X, Agarose (Invitrogen), Ethidium bromide (Invitrogen); muối (NaCl), cồn etylic, nƣớc cất, nƣớc muối sinh lý.
Một số hóa chất cần thiết khác để nghiên cứu ký sinh trùng và sinh học phân tử. Máy móc, thiết bị: Máy đo nồng độ DNA (BioDrop – UK), máy PCR
Mastercycler pro S (Eppendorf, Đức)(GeneAmp PCR system 9700 AB), máy đọc và chụp ảnh gel GelDoc (Biorad, Mỹ), bộ điện di sản phẩm PCR ngang Midigel XL (Apelex, Pháp), Bộ điện di nhỏ MGU – 102T (CBS Scientific Co, Mỹ), máy ly tâm lạnh VSAID Centrifuge 5415R (Eppendorf, Đức), Vortex MS3 (IKA, Đức), bể điều nhiệt cách thủy NB301L (N-BIOTEK, Hàn Quốc), Cân điện tử Adventurer Pro (Ohaus, Mỹ), Tủ lạnh SR-20KN (Sanyo, Nhật
21
Bản), lò vi sóng. Kính hiển vi soi nổi, kính lúp, kính hiển vi có gắn Micrometer thị kính, lá kính, phiến kính, ống eppendorf, micropipet, pipet tip, bộ đồ mổ gia súc, ống hút nhựa, hộp lồng, chai thủy tinh nút vặn, chai thủy tinh nút mài, cốc thủy tinh chia vạch,...
2.3PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phƣơng pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên vịt
Phƣơng pháp chọn mẫu: chọn mẫu ngẫu nhiên đơn.
Tiến hành mổ khám vịt để xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ. Các chỉ tiêu khảo sát:
Giống vịt: vịt siêu trứng (giống vịt triết giang và khakicampbell); vịt siêu thịt (giống vịt CV Supper M và vịt Bắc Kinh ).
Nhóm tuổi: vịt con (0-8 tuần tuổi); vịt hậu bị (8-24 tuần tuổi); vịt sinh sản (trên 24 tuần tuổi).
Hình thức nuôi: nuôi nhốt và nuôi chăn thả.
Tính dung lƣợng mẫu tối thiểu bằng phần mềm WinEpicope 2.0. So sánh sai khác bằng phần mềm Epicalc 2000 (Shift + F10/compare). - Tỷ lệ nhiễm chung (%)
ố ẫ ễ
ố ẫ ể
- Tỷ lệ nhiễm theo lứa tuổi (%)
ố ẫ ễ ừ ứ ổ
ố ẫ ể ù ứ ổ
- Tỷ lệ nhiễm theo phƣơng thức chăn nuôi (%)
ố ẫ ễ ừ ƣơ ứ
ố ẫ ể ù ƣơ ứ
Cách thu thập, tính số lƣợng: Dùng kim giải phẩu hoặc bút lông lấy sán cho vào
đĩa petri và đếm số lƣợng có trong đĩa.
Bảo quản mẫu: rửa sán với nƣớc muối sinh lý, bảo quản trong cồn 70o hoặc - 20oC để nghiên cứu cấu trúc phân tử.
22
Nội dung viết trên nhãn: địa điểm thu mẫu, tên động vật, sơ bộ phân loại, vị trí ký sinh, thời gian,…
Nội dung viết trên sổ: số thứ tự, thời gian mổ khám, tên loài động vật, lứa tuổi, địa điểm, những biến đổi bệnh lý của vị trí ký sinh, số lƣợng sán, mô tả đặc điểm hình thái, sơ bộ phân loại,…
2.3.2Phƣơng pháp định danh loài
Tóm tắt các bƣớc định danh loài nhƣ sau
Rửa mẫu bằng nƣớc muối sinh lý
Mô tả hình thái cấu tạo
Chuỗi nucleotit thu nhận So sánh trình tự nucleotit bằng phần mềm BioEdit Tìm kiếm, so sánh trình tự tƣơng đồng bằng chƣơng trình Blast Tạo cây phả hệ bằng phần mềm Mega
Định loài bằng hình thái học Định loài bằng kỹ thuật phân tử
Nhuộm carmine
Chiết tách DNA tổng số
Thực hiện phản ứng PCR
Giải trình tự gen COI Bảo quản mẫu trong cồn 700
Bảo quản mẫu trong cồn 700
hoặc - 200C
23
2.3.2.1.Phƣơng pháp nghiên cứu hình thái học Pha thuốc nhuộm:
Dung dịch AFA Formaldehyde 37% 10 ml
Ethanol 95% 5 ml
Axít acetic 2 ml
Nƣớc cất 40 ml
Semichon’s carmine Axít acetic 50 ml
Nƣớc cất 50 ml
Carmine Pha bảo hòa
Cho Semichon’s carmine vào lò vi sóng, nhiệt độ 90 oC trong 15 phút. Sau đó lọc hỗn dịch qua giấy lọc để loại bỏ chất cặn của thuốc nhuộm.
Dung dịch tẩy màu Axít hydrochloric 1 ml
Ethanol 70% 100 ml
Kỹ thuật nhuộm sán trƣởng thành (Semichon’s acetic carmine 1929) 1. Ngâm mẫu sán vào dung dịch AFA, để qua đêm.
2. Lấy sán cho vào cồn 70%, thời gian 30 phút.
3. Cho mẫu sán vào đĩa petri, ngâm với dung dịch Semichon’s carmine, thời gian 60 phút.
4. Rửa mẫu sán với cồn 70% trong 30 phút
5. Ngâm sán trong dung dịch tẩy màu. Mỗi lần 5 phút, lặp lại cho đến khi sán chuyển sang màu hồng.
6. Làm khô nƣớc từ mẫu sán với nồng độ cồn từ thấp tới cao (70%; 80% và cồn tuyệt đối), thời gian mỗi lần 30 phút.
7. Cuối cùng, mẫu sán đƣợc ngâm trong dung dịch xylene 1 phút để làm trong suốt. Lấy sán ra, thấm khô, đặt lên phiến kính và gắn lamen có dán keo canada. Soi mẫu dƣới kính hiển vi để phân loại.
24
Phân loại
Tổng số 50 mẫu sán trƣởng thành thu thập trên vịt ở Bình Định đƣợc phân loại dựa theo khóa phân loại sán lá “Trematoda” (David et al., 2008). Bao gồm hình thái, vị trí các cơ quan tổ chức: giác miệng, giác bụng, hầu, thực quản, manh tràng, tử cung, tinh hoàn, tuyến noãn hoàng, hệ thống bài tiết.
Hình 2.1: Hình thái, cấu tạo của sán trƣởng thành
Ghi chú: BDW (chiều rộng cơ thể), BDL (chiều dài cơ thể), VSW (chiều rộng giác bụng), OSW (chiều rộng giác miệng), OSL (chiều dài giác miệng), VSL (chiều dài giác bụng), OS (thực quản), OvL (chiều dài noãng sào), OvW (chiều rộng noãng sào), TsL (chiều dài tinh hoàn), TsW (chiều rộng tinh hoàn).
2.3.2.2. Định danh loài bằng kỹ thuật phân tử
Các mẫu sán đƣợc phân tích hình thái học, chia làm 2 nhóm: Nhóm có hình thái điển hình, chọn mẫu làm PCR.
Nhóm có hình thái không điển hình, chọn mẫu làm PCR. Phƣơng pháp chiết tách DNA tổng số
Cho 25 mg mẫu sán vào ống Eppendorf, thêm 180 µl Buffer ATL, thêm 20 µl proteinase K, Vortex nhẹ. Ủ ở 56 oC trong bể điều nhiệt cách thủy đến khi mô đƣợc phân hủy hoàn toàn (khoảng 1 đến 3 giờ).
Vortex, thêm 200 µl Buffer AL, Vortex, thêm 200 µl Ethanol pure, Vortex.
Chuyển toàn bộ huyền dịch mẫu sang ống có màng lọc DNeasy (mini colum). Sau đó ly tâm ở 20 oC, 8000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch ly tâm bên dƣới, giữ lại phần cột có màng lọc.
Thêm 500 µl Buffer AW1, ly tâm ở 20 oC, 8000 vòng trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm. Thêm 500 µl Buffer AW2, ly tâm ở 20 oC, 13000 vòng trong 3 phút, bỏ dịch ly tâm.
25
Lấy ống có màng lọc đặt vào ống Eppendorf 1,5 ml (ống mới), ghi ký hiệu mẫu. Thêm 200 µl Buffer AE, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Sau đó ly tâm ở 20 oC, 8000 vòng trong 1 phút. Thu dịch ly tâm trong ống Eppendorf (dịch ly tâm chính là DNA tổng số), bảo quản âm 20 oC.
Trình tự các bƣớc chuẩn hóa PCR đƣợc thiết lập nhƣ sau:
- Xác định nồng độ mồi tối ƣu và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu cho phản ứng PCR: Thí nghiệm xác định các nồng độ mồi khác nhau 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol trong phản ứng PCR khi các thành phần khác vẫn giữ nguyên. Kết hợp với thay đổi nồng độ mồi, cùng với sự thay đổi điều kiện phản ứng PCR ở các mức nhiệt độ khác nhau: 50 oC, 52 oC, 54 oC và 56 oC. Nhƣ vậy, với 16 cặp nghiệm thức đƣợc thiết lập ở bảng 2.1 để tìm nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu cho phản ứng PCR.
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu cho phản ứng PCR Các nghiệm thức Nhiệt độ bắt cặp (To C) T1=50 T2=52 T3=54 T4=56 Nồng độ mồi M1= 5 pmol M1T1 M1T2 M1T3 M1T4 M2=10 pmol M2T1 M2T2 M2T3 M2T4 M3= 15pmol M3T1 M3T2 M3T3 M3T4 M4= 20 pmol M4T1 M4T2 M4T3 M4T4
Tổng cộng các thành phần phản ứng PCR là 25 µl, bao gồm: PCR master mix 12,5 µl; mồi xuôi 1 µl (nồng độ phản ứng 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol); mồi ngƣợc 1 µl (nồng độ phản ứng 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol); nƣớc 5,5 µl; DNA mẫu 5 µl.
Trình tự cặp mồi gen COI (Bowles et al., 1993):
mồi xuôi : GGGTTYGGTATRRTKAGWCAC;
mồi ngƣợc: AAACCAAGTRTCATGMAACAAAG
(kích thƣớc sản phẩm khoảng 360 bp).
Các bƣớc của phản ứng PCR: 1 chu kỳ 94oC trong 1 phút 30 giây, tiếp theo là 30 chu kỳ 94oC trong 1 phút 30 giây, 50-56oC (thay đổi trong từng nghiệm thức) trong 1 phút 30 giây, 72oC trong 2 phút, cuối cùng là 1 chu kỳ 72oC 10 phút, giữ mẫu 4 oC.
26
Nồng độ DNA mẫu đƣợc pha loãng theo các cấp số nồng độ thấp dần: 1 µg/µl; 0,5 µg/µl; 0,3 µg/µl; 0,1 µg/µl (5 µl/phản ứng). Nồng độ DNA tối ƣu đƣợc đánh giá ở mức tối thiểu có thể phát hiện.
Điện di sản phẩm
Chuẩn bị khuôn đổ thạch, gắn lƣợc vào khuôn.
Tiến hành: đun chảy thạch bằng lò vi sóng (khi dung dịch bắt đầu sôi thì lấy bình ra lắc nhẹ, cho bình vào lò vi sóng đun tiếp cho tới khi thạch tan chảy hoàn toàn). Để