Ghi chú: BDW (chiều rộng cơ thể), BDL (chiều dài cơ thể), VSW (chiều rộng giác bụng), OSW (chiều rộng giác miệng), OSL (chiều dài giác miệng), VSL (chiều dài giác bụng), OS (thực quản), OvL (chiều dài noãng sào), OvW (chiều rộng noãng sào), TsL (chiều dài tinh hoàn), TsW (chiều rộng tinh hoàn).
2.3.2.2. Định danh loài bằng kỹ thuật phân tử
Các mẫu sán đƣợc phân tích hình thái học, chia làm 2 nhóm: Nhóm có hình thái điển hình, chọn mẫu làm PCR.
Nhóm có hình thái khơng điển hình, chọn mẫu làm PCR. Phƣơng pháp chiết tách DNA tổng số
Cho 25 mg mẫu sán vào ống Eppendorf, thêm 180 µl Buffer ATL, thêm 20 µl proteinase K, Vortex nhẹ. Ủ ở 56 oC trong bể điều nhiệt cách thủy đến khi mô đƣợc phân hủy hoàn toàn (khoảng 1 đến 3 giờ).
Vortex, thêm 200 µl Buffer AL, Vortex, thêm 200 µl Ethanol pure, Vortex.
Chuyển tồn bộ huyền dịch mẫu sang ống có màng lọc DNeasy (mini colum). Sau đó ly tâm ở 20 oC, 8000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch ly tâm bên dƣới, giữ lại phần cột có màng lọc.
Thêm 500 µl Buffer AW1, ly tâm ở 20 oC, 8000 vòng trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm. Thêm 500 µl Buffer AW2, ly tâm ở 20 oC, 13000 vòng trong 3 phút, bỏ dịch ly tâm.
25
Lấy ống có màng lọc đặt vào ống Eppendorf 1,5 ml (ống mới), ghi ký hiệu mẫu. Thêm 200 µl Buffer AE, ủ ở nhiệt độ phịng trong 1 phút. Sau đó ly tâm ở 20 oC, 8000 vịng trong 1 phút. Thu dịch ly tâm trong ống Eppendorf (dịch ly tâm chính là DNA tổng số), bảo quản âm 20 oC.
Trình tự các bƣớc chuẩn hóa PCR đƣợc thiết lập nhƣ sau:
- Xác định nồng độ mồi tối ƣu và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu cho phản ứng PCR: Thí nghiệm xác định các nồng độ mồi khác nhau 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol trong phản ứng PCR khi các thành phần khác vẫn giữ nguyên. Kết hợp với thay đổi nồng độ mồi, cùng với sự thay đổi điều kiện phản ứng PCR ở các mức nhiệt độ khác nhau: 50 oC, 52 oC, 54 oC và 56 oC. Nhƣ vậy, với 16 cặp nghiệm thức đƣợc thiết lập ở bảng 2.1 để tìm nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu cho phản ứng PCR.
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu cho phản ứng PCR Các nghiệm thức Nhiệt độ bắt cặp (T o C) T1=50 T2=52 T3=54 T4=56 Nồng độ mồi M1= 5 pmol M1T1 M1T2 M1T3 M1T4 M2=10 pmol M2T1 M2T2 M2T3 M2T4 M3= 15pmol M3T1 M3T2 M3T3 M3T4 M4= 20 pmol M4T1 M4T2 M4T3 M4T4
Tổng cộng các thành phần phản ứng PCR là 25 µl, bao gồm: PCR master mix 12,5 µl; mồi xi 1 µl (nồng độ phản ứng 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol); mồi ngƣợc 1 µl (nồng độ phản ứng 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol); nƣớc 5,5 µl; DNA mẫu 5 µl.
Trình tự cặp mồi gen COI (Bowles et al., 1993):
mồi xuôi : GGGTTYGGTATRRTKAGWCAC;
mồi ngƣợc: AAACCAAGTRTCATGMAACAAAG
(kích thƣớc sản phẩm khoảng 360 bp).
Các bƣớc của phản ứng PCR: 1 chu kỳ 94oC trong 1 phút 30 giây, tiếp theo là 30 chu kỳ 94oC trong 1 phút 30 giây, 50-56oC (thay đổi trong từng nghiệm thức) trong 1 phút 30 giây, 72oC trong 2 phút, cuối cùng là 1 chu kỳ 72oC 10 phút, giữ mẫu 4 oC.
26
Nồng độ DNA mẫu đƣợc pha loãng theo các cấp số nồng độ thấp dần: 1 µg/µl; 0,5 µg/µl; 0,3 µg/µl; 0,1 µg/µl (5 µl/phản ứng). Nồng độ DNA tối ƣu đƣợc đánh giá ở mức tối thiểu có thể phát hiện.
Điện di sản phẩm
Chuẩn bị khuôn đổ thạch, gắn lƣợc vào khuôn.
Tiến hành: đun chảy thạch bằng lị vi sóng (khi dung dịch bắt đầu sơi thì lấy bình ra lắc nhẹ, cho bình vào lị vi sóng đun tiếp cho tới khi thạch tan chảy hoàn toàn). Để thạch nguội tới 45 oC đến 50 oC thì bổ sung ethidium bromide (6 l), lắc đều, đổ vào khn lƣợc. Khi thạch đơng thì gỡ hai gờ khn và lƣợc (kéo nhẹ nhàng, tránh làm thủng lỗ). Đổ đệm TBE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt thạch khoảng 2 mm.
Nạp mẫu: lấy 10 µl mẫu sau khi đã chạy PCR, trộn với 1 µl chỉ thị màu Loading Dye và nạp riêng biệt mỗi mẫu vào từng giếng. Cho DNA marker (10 µl) vào giếng đầu hoặc giếng cuối.
Phân tích sản phẩm PCR
Sau khi tra mẫu, sản phẩm PCR đƣợc điện di trên thạch agarose 1,2%, với hiệu điện thế 100V trong 40 phút. Đọc kết quả bằng máy đọc và chụp ảnh gel.
Ứng dụng quy trình chẩn đốn để giám định, phân loại
Sau khi hồn chỉnh việc chuẩn hóa quy trình PCR, quy trình này đƣợc áp dụng để thực hiện giám định, phân loại những mẫu sán lá gan nhỏ thu thập đƣợc trên vịt ở Bình Định. Trình tự các bƣớc nhƣ sau:
Thực hiện phản ứng PCR; Tinh sạch sản phẩm PCR;
Giải trình tự sản phẩm PCR để thu nhận chuỗi nucleotit (Công ty Macogen Inc, Hàn Quốc). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
So sánh, phân loại
So sánh trình tự nucleotit sử dụng BioEdit 2000 (New alignment/file/Import/Sequence alignment file/Accessory /Clustalw alignment/Run clustal).
Chuỗi nucleotit sử dụng truy cập ngân hàng gen qua chƣơng trình Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) (nucleotide blast/blastn/other/highly similar sequence/show result in a window.
Tạo cây phả hệ sử dụng phần mềm Mega (File/open/nucleotide sequence/ok. Phylogegy/construct/test neighther Join Tree/ok/conputer/save.
27
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ trên vịt ở huyện An Nhơn và Tuy Phƣớc, tỉnh Bình Định tỉnh Bình Định
Bảng 3.1: Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên vịt ở huyện An Nhơn và Tuy Phƣớc Địa Địa điểm Tổng số vịt nhiễm/tổng số vịt mổ khám (%) Giống vịt Nhóm tuổi vịt Hình thức ni Siêu trứng Siêu thịt Vịt con Hậu bị Sinh sản Nuôi nhốt Nuôi chăn thả An Nhơn 29/120 (24,16) 27/70 (38,57) 2/50 (4,0) 0/20 (0,00) 9/45 (20,0) 20/55 (36,36) 13/60 (21,66) 16/60 (26,66) Tuy Phƣớc 39/120 (32,50) 30/70 (42,85) 9/50 (18,0) 0/20 (0,00) 12/45 (26,66) 27/55 (49,09) 15/60 (25,0) 24/60 (40,0) Tổng cộng 68/240 (28,33) 57/140 (40,71) 11/100 (11,0) 0/40 (0,0) 21/90 (23,33) 47/110 (42,72) 28/120 (23,33) 40/120 (33,33)
Tổng số 240 vịt đƣợc mổ khám ở huyện An Nhơn và Tuy Phƣớc, tỉnh Bình Định, có 68 con nhiễm sán lá gan nhỏ, chiếm tỷ lệ 28,33%. Trong đó tỷ lệ nhiễm trên vịt ở huyện An Nhơn là 24,16% (29/120) và ở huyện Tuy Phƣớc là 32,50% (39/120). Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm phụ thuộc vào các giống vịt, nhóm tuổi và hình thức ni, cụ thể nhƣ sau:
Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên giống vịt siêu trứng là 40,71% cao hơn so với giống vịt siêu thịt 11,0% (P<0,05).
Vịt giai đoạn sinh sản nhiễm sán lá gan nhỏ cao hơn nhóm vịt khác (P<0,05), cụ thể: vịt con (0-8 tuần tuổi) chƣa nhiễm sán, trong khi đó tỷ lệ nhiễm trên vịt hậu bị là 23,33% và vịt sinh sản 42,72%.
Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên vịt ở nuôi chăn thả là 33,33% và 23,33% ở nuôi nhốt. Qua phân tích thống kê cho thấy khơng có sự khác nhau về tỷ lệ nhiễm giữa 2 hình thức ni (P>0,05).
Bệnh sán lá gan nhỏ trên vịt chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều, cho đến nay trên thế giới chỉ có thơng báo vịt ở Pakixtan nhiễm sán lá gan nhỏ, loài Opisthorchis lobatus (Thaenkham et al., 2011).
28
Ở nƣớc ta, vịt nhiễm sán lá gan nhỏ đƣợc phát hiện ở Hải Phòng và Lạng Sơn năm 1962, Thanh Hóa năm 1964, Hà Nội năm 1971 (Đỗ Dƣơng Thái, 1977), những năm sau đó có một số nghiên cứu tình trạng nhiễm giun sán trên vịt nhƣng cũng không phát hiện vịt nhiễm sán lá gan nhỏ: Hồ Thị Thuận (1988) và Huỳnh Tấn Phúc (2001) nghiên cứu ở TP Hồ Chí Minh; Nguyễn Đình Bảo (2003) nghiên cứu ở tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu; Nguyễn Hữu Hƣng (2007) nghiên cứu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long; Nguyễn Xuân Dƣơng (2008) nghiên cứu ở Thái Bình, Nam Định, Hải Dƣơng,… Kết quả khảo sát này cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên vịt ở 2 huyện Tuy Phƣớc và An Nhơn, tỉnh Bình Định là khá cao (28,33%).
Bệnh sán lá gan nhỏ trên vịt xuất hiện ở huyện Tuy Phƣớc và An Nhơn, tỉnh Bình Định có thể do tính đặc trƣng của vùng. Tuy Phƣớc và An Nhơn là huyện đồng bằng, có nhiều lƣu vực sơng, các đầm lầy, ao hồ,… là những điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh phát triển. Có thể ở vùng này có đủ các yếu tố cấu thành dịch bệnh: mầm bệnh, vật chủ cảm thụ và các yếu tố cần thiết khác để khép kín đƣợc vịng đời (vật chủ trung gian), nên bệnh sán lá gan nhỏ có điều kiện phát sinh trên vịt.
3.2. Kết quả định danh lồi bằng hình thái học
Tổng số 120 mẫu sán lá gan nhỏ thu thập trên vịt ở tỉnh Bình Định đƣợc nhuộm carmin để nghiên cứu hình thái học. Kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy, sán trƣởng thành có hình chiếc lá thon dần về 2 đầu, chiều dài từ 7,1-12,2 mm (trung bình 8,5 mm), chiều rộng từ 1,2-1,9 mm (trung bình 1,4 mm). Giác miệng nằm ở phần trƣớc cơ thể, kích thƣớc 200 x 265 μm. Giác bụng lớn hơn giác miệng, nằm một phần tƣ phía trƣớc cơ thể sán, kích thƣớc 275 x 320 μm. Hầu trịn, nhỏ hơn giác miệng, kích thƣớc 155 x 165 μm; tiếp theo là thực quản ngắn, chiều dài 255 μm.
Manh tràng nhỏ, phân ra 2 nhánh chạy từ phía trƣớc đến phía sau cơ thể sán. Tử cung chứa đầy trứng, uốn khúc, nằm phía trong manh tràng; kéo dài từ buồng trứng về phía trƣớc cơ thể. Buồng trứng phân thành 3 thùy, trông giống nhƣ 3 cánh hoa, nằm một phần 3 phía sau cơ thể sán, kích thƣớc 450 x 650 μm. Tuyến Mehlis nằm gần buồng trứng.
Túi chứa tinh dạng ống, uốn lƣợn, chạy từ phía trƣớc cơ thể đến phần giác bụng, tạo thành lỗ sinh dục ở trƣớc giác bụng. Hai tinh hồn phân thùy, nằm phía trong manh tràng, chiếm phần lớn chiều rộng phía sau cơ thể sán, chồng lên cả manh tràng. Chiều rộng tinh hoàn lớn hơn chiều dài. Tinh hoàn sau lớn hơn tinh hoàn trƣớc. Các
29
ống dẫn tinh bắt đầu từ mỗi tinh hồn chạy về phía trƣớc, gộp lại tạo thành túi chứa tinh.
Tuyến nỗn hồng ở 2 bên thân sán, nằm phía ngồi manh tràng; mỗi tuyến có 8-9 cụm, bắt đầu từ giác bụng kéo dài đến phía trƣớc hoặc phía sau của tinh hồn. Bàng quang nhỏ, nằm phía sau cơ thể, tới tinh hồn. Trứng sán có hình bầu dục, màu vàng nhạt, đầu nhỏ có nắp trứng, chiều dài 25-32 μm (trung bình 28 μm), chiều rộng 12-15 μm (trung bình 13,5 μm).
Từ những đặc điểm cấu tạo ở trên và căn cứ theo khóa phân loại sán lá của David et al. (2008) cho thấy, những mẫu sán lá gan nhỏ thu thập trên vịt ở Bình Định thuộc giống Opisthorchis, họ Opisthorchiidae, bộ Plagiorchiida, phân lớp Digenea, lớp Trematoda, ngành Platyhelminthes. Về hình thái cấu tạo, sán lá gan nhỏ thu thập trên vịt ở Bình Định có hình thái giống với lồi ký sinh trong gan vịt ở miền Bắc, loài này đƣợc Nguyễn Thị Lê phát hiện năm 1968 và đƣợc đặt tên Opisthorchis paragenimus
(Oschmarin, 1970).
Sán lá gan nhỏ ký sinh trên vịt ở Bình Định có kích thƣớc lớn hơn các lồi sán lá gan nhỏ khác đã đƣợc công bố (O. lobatus và O. viverrini). Cụ thể sán lá gan nhỏ trên vịt ở Bình Định, chiều dài 7,1-12,3 mm, chiều rộng 1,2-1,9 mm; trong khi đó sán lá gan nhỏ lồi O. lobatus chiều dài 3,62-5,60 mm, chiều rộng 0,72-1,2 mm; loài O. viverrini chiều dài 4,18-7,0 mm x chiều rộng 1,2 -1,8 mm (Thaenkhan et al., 2011).
30
Bảng 3.2: Kích thƣớc sán lá gan nhỏ trên vịt ở Bình Định (n=120)
Cơ quan Dao động Trung Bình (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cơ thể (mm) L 7,1-12,2 8,5 W 1,2-1,9 1,4 Giác miệng (µm) L 180-290 200 W 240-310 265 Hầu (µm) L 120-190 155 W 150-180 165 Thực quản (µm) L 230-360 255 Giác bụng (µm) L 220-360 275 W 280-370 320 Buồng trứng (µm) L 380-700 450 W 460-800 650 Tinh hồn trƣớc (µm) L 600-900 700 W 900-1200 1000 Tinh hồn sau (µm) L 700-1100 950 W 900-1500 1150 Trứng L 25-32 28,0 W 12-15 13,5
31