1: Hình thái sán trƣởng thành (nhìn bằng mắt thƣờng, mỗi vạch 1 mm); 2: Hình thái trứng (40 x, mỗi vạch x 2,5 µm); 3: Phần đầu sán (10 x); 4: Phần giữa cơ thể sán (10
x); 5: Phần đuôi sán (10 x)
3.3. Kết quả tối ƣu hóa kỹ thuật PCR phát hiện sán lá gan nhỏ trên vịt Kết quả xác định nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu Kết quả xác định nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu
Bốn nồng độ mồi, mồi xuôi (5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol), mồi ngƣợc (5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol) ở mức nhiệt độ bắt cặp khác nhau (50 oC, 52 oC, 54 o
C, 56oC) đƣợc thí nghiệm trong phản ứng PCR. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3: Qua bảng 3.3 với 16 nghiệm thức cho thấy sự tác động qua lại giữa nhiệt độ bắt cặp và nồng độ mồi khác nhau. Sau khi điện di trên gel, sản phẩm PCR của 16 nghiệm thức đều nhân đƣợc đoạn gen có độ dài khoảng 360 bp, nhƣng mức độ rõ và kích thƣớc của băng sản phẩm ở các nghiệm thức là khác nhau, cụ thể nhƣ sau:
1 2
32
Ở nhiệt độ 50 oC và nồng độ mồi 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol: Sản phẩm PCR ở mức từ 1-2+, băng sản phẩm mờ hoặc kích thƣớc hẹp.
Ở nhiệt độ 52 oC và nồng độ mồi 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol: Sản phẩm PCR ở mức 3+, băng sản phẩm rõ hoặc kích thƣớc dày. Tuy nhiên ở nồng độ mồi thấp 10 pmol băng sản phẩm hơi mờ.
Ở nhiệt độ 54 oC và nồng độ mồi 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol: Sản phẩm PCR ở mức từ 1-2+, băng sản phẩm mờ hoặc kích thƣớc hẹp.
Ở nhiệt độ 56 oC và nồng độ mồi 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol: Sản phẩm PCR ở mức từ 1-2+, băng sản phẩm mờ hoặc kích thƣớc hẹp.
Từ kết quả trên cho thấy, nhiệt độ bắt cặp 52 oC và nồng độ mồi 10 pmol là tối ƣu nhất cho phản ứng PCR phát hiện sán lá gan nhỏ.
Bảng 3.3 Tác động qua lại giữa nhiệt độ bắt cặp và nồng độ mồi
Các nghiệm thức Nhiệt độ bắt cặp (T o C) T1=50 T2=52 T3=54 T4=56 Nồng độ mồi M1=5 pmol + ++ + + M2= 10 pmol ++ +++ ++ ++ M3=15 pmol ++ +++ ++ + M4=20 pmol ++ +++ ++ + Ghi chú:
(1+): băng sản phẩm mờ; (2+): băng sản phẩm rõ nét, kích thƣớc hẹp; (3+): băng sản phẩm rõ nét, kích thƣớc dày.
Kết quả xác định nồng độ DNA mẫu tối thiểu phát hiện
Nhiệt độ bắt cặp 52 oC và nồng độ mồi 10 pmol là tối ƣu nhất cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, ở nồng độ DNA mẫu đƣợc pha loãng theo các cấp số 1; 0,5; 0,3 và 0,1 µg/µl, thì ở mức 0,3 µg/µl(5 µl/phản ứng) là nồng độ tối ƣu đƣợc ở mức tối thiểu có thể phát hiện.
33
360 bp
Hình 3.2: Kết quả khảo sát nồng độ mồi ở 50 oC