Chƣơng 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2 Phƣơng pháp định danh loài
Tóm tắt các bƣớc định danh lồi nhƣ sau
Rửa mẫu bằng nƣớc muối sinh lý
Mơ tả hình thái cấu tạo
Chuỗi nucleotit thu nhận So sánh trình tự nucleotit bằng phần mềm BioEdit Tìm kiếm, so sánh trình tự tƣơng đồng bằng chƣơng trình Blast Tạo cây phả hệ bằng phần mềm Mega
Định lồi bằng hình thái học Định loài bằng kỹ thuật phân tử
Nhuộm carmine
Chiết tách DNA tổng số
Thực hiện phản ứng PCR
Giải trình tự gen COI Bảo quản mẫu trong cồn 700
Bảo quản mẫu trong cồn 700
hoặc - 200C
23
2.3.2.1.Phƣơng pháp nghiên cứu hình thái học Pha thuốc nhuộm:
Dung dịch AFA Formaldehyde 37% 10 ml
Ethanol 95% 5 ml
Axít acetic 2 ml
Nƣớc cất 40 ml
Semichon’s carmine Axít acetic 50 ml
Nƣớc cất 50 ml
Carmine Pha bảo hòa
Cho Semichon’s carmine vào lị vi sóng, nhiệt độ 90 oC trong 15 phút. Sau đó lọc hỗn dịch qua giấy lọc để loại bỏ chất cặn của thuốc nhuộm.
Dung dịch tẩy màu Axít hydrochloric 1 ml
Ethanol 70% 100 ml
Kỹ thuật nhuộm sán trƣởng thành (Semichon’s acetic carmine 1929) 1. Ngâm mẫu sán vào dung dịch AFA, để qua đêm.
2. Lấy sán cho vào cồn 70%, thời gian 30 phút.
3. Cho mẫu sán vào đĩa petri, ngâm với dung dịch Semichon’s carmine, thời gian 60 phút.
4. Rửa mẫu sán với cồn 70% trong 30 phút
5. Ngâm sán trong dung dịch tẩy màu. Mỗi lần 5 phút, lặp lại cho đến khi sán chuyển sang màu hồng.
6. Làm khô nƣớc từ mẫu sán với nồng độ cồn từ thấp tới cao (70%; 80% và cồn tuyệt đối), thời gian mỗi lần 30 phút.
7. Cuối cùng, mẫu sán đƣợc ngâm trong dung dịch xylene 1 phút để làm trong suốt. Lấy sán ra, thấm khơ, đặt lên phiến kính và gắn lamen có dán keo canada. Soi mẫu dƣới kính hiển vi để phân loại.
24
Phân loại
Tổng số 50 mẫu sán trƣởng thành thu thập trên vịt ở Bình Định đƣợc phân loại dựa theo khóa phân loại sán lá “Trematoda” (David et al., 2008). Bao gồm hình thái, vị trí các cơ quan tổ chức: giác miệng, giác bụng, hầu, thực quản, manh tràng, tử cung, tinh hoàn, tuyến nỗn hồng, hệ thống bài tiết.
Hình 2.1: Hình thái, cấu tạo của sán trƣởng thành
Ghi chú: BDW (chiều rộng cơ thể), BDL (chiều dài cơ thể), VSW (chiều rộng giác bụng), OSW (chiều rộng giác miệng), OSL (chiều dài giác miệng), VSL (chiều dài giác bụng), OS (thực quản), OvL (chiều dài noãng sào), OvW (chiều rộng nỗng sào), TsL (chiều dài tinh hồn), TsW (chiều rộng tinh hoàn).
2.3.2.2. Định danh loài bằng kỹ thuật phân tử
Các mẫu sán đƣợc phân tích hình thái học, chia làm 2 nhóm: Nhóm có hình thái điển hình, chọn mẫu làm PCR.
Nhóm có hình thái khơng điển hình, chọn mẫu làm PCR. Phƣơng pháp chiết tách DNA tổng số
Cho 25 mg mẫu sán vào ống Eppendorf, thêm 180 µl Buffer ATL, thêm 20 µl proteinase K, Vortex nhẹ. Ủ ở 56 oC trong bể điều nhiệt cách thủy đến khi mô đƣợc phân hủy hoàn toàn (khoảng 1 đến 3 giờ).
Vortex, thêm 200 µl Buffer AL, Vortex, thêm 200 µl Ethanol pure, Vortex.
Chuyển toàn bộ huyền dịch mẫu sang ống có màng lọc DNeasy (mini colum). Sau đó ly tâm ở 20 oC, 8000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch ly tâm bên dƣới, giữ lại phần cột có màng lọc.
Thêm 500 µl Buffer AW1, ly tâm ở 20 oC, 8000 vòng trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm. Thêm 500 µl Buffer AW2, ly tâm ở 20 oC, 13000 vòng trong 3 phút, bỏ dịch ly tâm.
25
Lấy ống có màng lọc đặt vào ống Eppendorf 1,5 ml (ống mới), ghi ký hiệu mẫu. Thêm 200 µl Buffer AE, ủ ở nhiệt độ phịng trong 1 phút. Sau đó ly tâm ở 20 oC, 8000 vòng trong 1 phút. Thu dịch ly tâm trong ống Eppendorf (dịch ly tâm chính là DNA tổng số), bảo quản âm 20 oC.
Trình tự các bƣớc chuẩn hóa PCR đƣợc thiết lập nhƣ sau:
- Xác định nồng độ mồi tối ƣu và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu cho phản ứng PCR: Thí nghiệm xác định các nồng độ mồi khác nhau 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol trong phản ứng PCR khi các thành phần khác vẫn giữ nguyên. Kết hợp với thay đổi nồng độ mồi, cùng với sự thay đổi điều kiện phản ứng PCR ở các mức nhiệt độ khác nhau: 50 oC, 52 oC, 54 oC và 56 oC. Nhƣ vậy, với 16 cặp nghiệm thức đƣợc thiết lập ở bảng 2.1 để tìm nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu cho phản ứng PCR.
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu cho phản ứng PCR Các nghiệm thức Nhiệt độ bắt cặp (T o C) T1=50 T2=52 T3=54 T4=56 Nồng độ mồi M1= 5 pmol M1T1 M1T2 M1T3 M1T4 M2=10 pmol M2T1 M2T2 M2T3 M2T4 M3= 15pmol M3T1 M3T2 M3T3 M3T4 M4= 20 pmol M4T1 M4T2 M4T3 M4T4
Tổng cộng các thành phần phản ứng PCR là 25 µl, bao gồm: PCR master mix 12,5 µl; mồi xi 1 µl (nồng độ phản ứng 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol); mồi ngƣợc 1 µl (nồng độ phản ứng 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol); nƣớc 5,5 µl; DNA mẫu 5 µl.
Trình tự cặp mồi gen COI (Bowles et al., 1993):
mồi xuôi : GGGTTYGGTATRRTKAGWCAC;
mồi ngƣợc: AAACCAAGTRTCATGMAACAAAG
(kích thƣớc sản phẩm khoảng 360 bp).
Các bƣớc của phản ứng PCR: 1 chu kỳ 94oC trong 1 phút 30 giây, tiếp theo là 30 chu kỳ 94oC trong 1 phút 30 giây, 50-56oC (thay đổi trong từng nghiệm thức) trong 1 phút 30 giây, 72oC trong 2 phút, cuối cùng là 1 chu kỳ 72oC 10 phút, giữ mẫu 4 oC.
26
Nồng độ DNA mẫu đƣợc pha loãng theo các cấp số nồng độ thấp dần: 1 µg/µl; 0,5 µg/µl; 0,3 µg/µl; 0,1 µg/µl (5 µl/phản ứng). Nồng độ DNA tối ƣu đƣợc đánh giá ở mức tối thiểu có thể phát hiện.
Điện di sản phẩm
Chuẩn bị khuôn đổ thạch, gắn lƣợc vào khuôn.
Tiến hành: đun chảy thạch bằng lị vi sóng (khi dung dịch bắt đầu sơi thì lấy bình ra lắc nhẹ, cho bình vào lị vi sóng đun tiếp cho tới khi thạch tan chảy hoàn toàn). Để thạch nguội tới 45 oC đến 50 oC thì bổ sung ethidium bromide (6 l), lắc đều, đổ vào khn lƣợc. Khi thạch đơng thì gỡ hai gờ khn và lƣợc (kéo nhẹ nhàng, tránh làm thủng lỗ). Đổ đệm TBE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt thạch khoảng 2 mm.
Nạp mẫu: lấy 10 µl mẫu sau khi đã chạy PCR, trộn với 1 µl chỉ thị màu Loading Dye và nạp riêng biệt mỗi mẫu vào từng giếng. Cho DNA marker (10 µl) vào giếng đầu hoặc giếng cuối.
Phân tích sản phẩm PCR
Sau khi tra mẫu, sản phẩm PCR đƣợc điện di trên thạch agarose 1,2%, với hiệu điện thế 100V trong 40 phút. Đọc kết quả bằng máy đọc và chụp ảnh gel.
Ứng dụng quy trình chẩn đốn để giám định, phân loại
Sau khi hồn chỉnh việc chuẩn hóa quy trình PCR, quy trình này đƣợc áp dụng để thực hiện giám định, phân loại những mẫu sán lá gan nhỏ thu thập đƣợc trên vịt ở Bình Định. Trình tự các bƣớc nhƣ sau:
Thực hiện phản ứng PCR; Tinh sạch sản phẩm PCR;
Giải trình tự sản phẩm PCR để thu nhận chuỗi nucleotit (Công ty Macogen Inc, Hàn Quốc).
So sánh, phân loại
So sánh trình tự nucleotit sử dụng BioEdit 2000 (New alignment/file/Import/Sequence alignment file/Accessory /Clustalw alignment/Run clustal).
Chuỗi nucleotit sử dụng truy cập ngân hàng gen qua chƣơng trình Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) (nucleotide blast/blastn/other/highly similar sequence/show result in a window.
Tạo cây phả hệ sử dụng phần mềm Mega (File/open/nucleotide sequence/ok. Phylogegy/construct/test neighther Join Tree/ok/conputer/save.
27
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ trên vịt ở huyện An Nhơn và Tuy Phƣớc, tỉnh Bình Định tỉnh Bình Định
Bảng 3.1: Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên vịt ở huyện An Nhơn và Tuy Phƣớc Địa Địa điểm Tổng số vịt nhiễm/tổng số vịt mổ khám (%) Giống vịt Nhóm tuổi vịt Hình thức ni Siêu trứng Siêu thịt Vịt con Hậu bị Sinh sản Nuôi nhốt Nuôi chăn thả An Nhơn 29/120 (24,16) 27/70 (38,57) 2/50 (4,0) 0/20 (0,00) 9/45 (20,0) 20/55 (36,36) 13/60 (21,66) 16/60 (26,66) Tuy Phƣớc 39/120 (32,50) 30/70 (42,85) 9/50 (18,0) 0/20 (0,00) 12/45 (26,66) 27/55 (49,09) 15/60 (25,0) 24/60 (40,0) Tổng cộng 68/240 (28,33) 57/140 (40,71) 11/100 (11,0) 0/40 (0,0) 21/90 (23,33) 47/110 (42,72) 28/120 (23,33) 40/120 (33,33)
Tổng số 240 vịt đƣợc mổ khám ở huyện An Nhơn và Tuy Phƣớc, tỉnh Bình Định, có 68 con nhiễm sán lá gan nhỏ, chiếm tỷ lệ 28,33%. Trong đó tỷ lệ nhiễm trên vịt ở huyện An Nhơn là 24,16% (29/120) và ở huyện Tuy Phƣớc là 32,50% (39/120). Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm phụ thuộc vào các giống vịt, nhóm tuổi và hình thức ni, cụ thể nhƣ sau:
Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên giống vịt siêu trứng là 40,71% cao hơn so với giống vịt siêu thịt 11,0% (P<0,05).
Vịt giai đoạn sinh sản nhiễm sán lá gan nhỏ cao hơn nhóm vịt khác (P<0,05), cụ thể: vịt con (0-8 tuần tuổi) chƣa nhiễm sán, trong khi đó tỷ lệ nhiễm trên vịt hậu bị là 23,33% và vịt sinh sản 42,72%.
Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên vịt ở nuôi chăn thả là 33,33% và 23,33% ở ni nhốt. Qua phân tích thống kê cho thấy khơng có sự khác nhau về tỷ lệ nhiễm giữa 2 hình thức ni (P>0,05).
Bệnh sán lá gan nhỏ trên vịt chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều, cho đến nay trên thế giới chỉ có thơng báo vịt ở Pakixtan nhiễm sán lá gan nhỏ, loài Opisthorchis lobatus (Thaenkham et al., 2011).
28
Ở nƣớc ta, vịt nhiễm sán lá gan nhỏ đƣợc phát hiện ở Hải Phịng và Lạng Sơn năm 1962, Thanh Hóa năm 1964, Hà Nội năm 1971 (Đỗ Dƣơng Thái, 1977), những năm sau đó có một số nghiên cứu tình trạng nhiễm giun sán trên vịt nhƣng cũng không phát hiện vịt nhiễm sán lá gan nhỏ: Hồ Thị Thuận (1988) và Huỳnh Tấn Phúc (2001) nghiên cứu ở TP Hồ Chí Minh; Nguyễn Đình Bảo (2003) nghiên cứu ở tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu; Nguyễn Hữu Hƣng (2007) nghiên cứu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long; Nguyễn Xuân Dƣơng (2008) nghiên cứu ở Thái Bình, Nam Định, Hải Dƣơng,… Kết quả khảo sát này cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên vịt ở 2 huyện Tuy Phƣớc và An Nhơn, tỉnh Bình Định là khá cao (28,33%).
Bệnh sán lá gan nhỏ trên vịt xuất hiện ở huyện Tuy Phƣớc và An Nhơn, tỉnh Bình Định có thể do tính đặc trƣng của vùng. Tuy Phƣớc và An Nhơn là huyện đồng bằng, có nhiều lƣu vực sơng, các đầm lầy, ao hồ,… là những điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh phát triển. Có thể ở vùng này có đủ các yếu tố cấu thành dịch bệnh: mầm bệnh, vật chủ cảm thụ và các yếu tố cần thiết khác để khép kín đƣợc vịng đời (vật chủ trung gian), nên bệnh sán lá gan nhỏ có điều kiện phát sinh trên vịt.
3.2. Kết quả định danh lồi bằng hình thái học
Tổng số 120 mẫu sán lá gan nhỏ thu thập trên vịt ở tỉnh Bình Định đƣợc nhuộm carmin để nghiên cứu hình thái học. Kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy, sán trƣởng thành có hình chiếc lá thon dần về 2 đầu, chiều dài từ 7,1-12,2 mm (trung bình 8,5 mm), chiều rộng từ 1,2-1,9 mm (trung bình 1,4 mm). Giác miệng nằm ở phần trƣớc cơ thể, kích thƣớc 200 x 265 μm. Giác bụng lớn hơn giác miệng, nằm một phần tƣ phía trƣớc cơ thể sán, kích thƣớc 275 x 320 μm. Hầu trịn, nhỏ hơn giác miệng, kích thƣớc 155 x 165 μm; tiếp theo là thực quản ngắn, chiều dài 255 μm.
Manh tràng nhỏ, phân ra 2 nhánh chạy từ phía trƣớc đến phía sau cơ thể sán. Tử cung chứa đầy trứng, uốn khúc, nằm phía trong manh tràng; kéo dài từ buồng trứng về phía trƣớc cơ thể. Buồng trứng phân thành 3 thùy, trông giống nhƣ 3 cánh hoa, nằm một phần 3 phía sau cơ thể sán, kích thƣớc 450 x 650 μm. Tuyến Mehlis nằm gần buồng trứng.
Túi chứa tinh dạng ống, uốn lƣợn, chạy từ phía trƣớc cơ thể đến phần giác bụng, tạo thành lỗ sinh dục ở trƣớc giác bụng. Hai tinh hồn phân thùy, nằm phía trong manh tràng, chiếm phần lớn chiều rộng phía sau cơ thể sán, chồng lên cả manh tràng. Chiều rộng tinh hoàn lớn hơn chiều dài. Tinh hoàn sau lớn hơn tinh hoàn trƣớc. Các
29
ống dẫn tinh bắt đầu từ mỗi tinh hồn chạy về phía trƣớc, gộp lại tạo thành túi chứa tinh.
Tuyến nỗn hồng ở 2 bên thân sán, nằm phía ngồi manh tràng; mỗi tuyến có 8-9 cụm, bắt đầu từ giác bụng kéo dài đến phía trƣớc hoặc phía sau của tinh hồn. Bàng quang nhỏ, nằm phía sau cơ thể, tới tinh hồn. Trứng sán có hình bầu dục, màu vàng nhạt, đầu nhỏ có nắp trứng, chiều dài 25-32 μm (trung bình 28 μm), chiều rộng 12-15 μm (trung bình 13,5 μm).
Từ những đặc điểm cấu tạo ở trên và căn cứ theo khóa phân loại sán lá của David et al. (2008) cho thấy, những mẫu sán lá gan nhỏ thu thập trên vịt ở Bình Định thuộc giống Opisthorchis, họ Opisthorchiidae, bộ Plagiorchiida, phân lớp Digenea, lớp Trematoda, ngành Platyhelminthes. Về hình thái cấu tạo, sán lá gan nhỏ thu thập trên vịt ở Bình Định có hình thái giống với lồi ký sinh trong gan vịt ở miền Bắc, loài này đƣợc Nguyễn Thị Lê phát hiện năm 1968 và đƣợc đặt tên Opisthorchis paragenimus
(Oschmarin, 1970).
Sán lá gan nhỏ ký sinh trên vịt ở Bình Định có kích thƣớc lớn hơn các lồi sán lá gan nhỏ khác đã đƣợc công bố (O. lobatus và O. viverrini). Cụ thể sán lá gan nhỏ trên vịt ở Bình Định, chiều dài 7,1-12,3 mm, chiều rộng 1,2-1,9 mm; trong khi đó sán lá gan nhỏ loài O. lobatus chiều dài 3,62-5,60 mm, chiều rộng 0,72-1,2 mm; loài O. viverrini chiều dài 4,18-7,0 mm x chiều rộng 1,2 -1,8 mm (Thaenkhan et al., 2011).
30
Bảng 3.2: Kích thƣớc sán lá gan nhỏ trên vịt ở Bình Định (n=120)
Cơ quan Dao động Trung Bình
Cơ thể (mm) L 7,1-12,2 8,5 W 1,2-1,9 1,4 Giác miệng (µm) L 180-290 200 W 240-310 265 Hầu (µm) L 120-190 155 W 150-180 165 Thực quản (µm) L 230-360 255 Giác bụng (µm) L 220-360 275 W 280-370 320 Buồng trứng (µm) L 380-700 450 W 460-800 650 Tinh hồn trƣớc (µm) L 600-900 700 W 900-1200 1000 Tinh hồn sau (µm) L 700-1100 950 W 900-1500 1150 Trứng L 25-32 28,0 W 12-15 13,5
31
Hình 3.1: Hình thái sán lá gan nhỏ ký sinh trên vịt ở Bình Định
1: Hình thái sán trƣởng thành (nhìn bằng mắt thƣờng, mỗi vạch 1 mm); 2: Hình thái trứng (40 x, mỗi vạch x 2,5 µm); 3: Phần đầu sán (10 x); 4: Phần giữa cơ thể sán (10
x); 5: Phần đuôi sán (10 x)
3.3. Kết quả tối ƣu hóa kỹ thuật PCR phát hiện sán lá gan nhỏ trên vịt Kết quả xác định nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu Kết quả xác định nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ƣu
Bốn nồng độ mồi, mồi xuôi (5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol), mồi ngƣợc (5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol) ở mức nhiệt độ bắt cặp khác nhau (50 oC, 52 oC, 54 o
C, 56oC) đƣợc thí nghiệm trong phản ứng PCR. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3: Qua bảng 3.3 với 16 nghiệm thức cho thấy sự tác động qua lại giữa nhiệt độ bắt cặp và nồng độ mồi khác nhau. Sau khi điện di trên gel, sản phẩm PCR của 16 nghiệm thức đều nhân đƣợc đoạn gen có độ dài khoảng 360 bp, nhƣng mức độ rõ và kích thƣớc của băng sản phẩm ở các nghiệm thức là khác nhau, cụ thể nhƣ sau:
1 2
32
Ở nhiệt độ 50 oC và nồng độ mồi 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol: Sản phẩm PCR ở mức từ 1-2+, băng sản phẩm mờ hoặc kích thƣớc hẹp.
Ở nhiệt độ 52 oC và nồng độ mồi 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol: Sản phẩm PCR ở mức 3+, băng sản phẩm rõ hoặc kích thƣớc dày. Tuy nhiên ở nồng độ mồi thấp 10 pmol băng sản phẩm hơi mờ.
Ở nhiệt độ 54 oC và nồng độ mồi 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol: Sản phẩm PCR ở mức từ 1-2+, băng sản phẩm mờ hoặc kích thƣớc hẹp.
Ở nhiệt độ 56 oC và nồng độ mồi 5 pmol; 10 pmol, 15 pmol; 20 pmol: Sản phẩm PCR ở mức từ 1-2+, băng sản phẩm mờ hoặc kích thƣớc hẹp.
Từ kết quả trên cho thấy, nhiệt độ bắt cặp 52 oC và nồng độ mồi 10 pmol là tối ƣu