y = 39825x + 102.1 R² = 0.999 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 0 5 10 15 20 25 D iệ n tích p ic Nồng độ chuẩn (µg/kg ) 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 0 5 10 15 20 25 D iệ n tích p íc nồng độ chuẩn (µg/kg ) Nền mẫu MeOH
Từ hình 3.17 cho thấy, đường chuẩn dựng trên nền mẫu và dung môi MeOH đều cùng đi qua chung gốc tọa độ và độ chệch giữa các điểm chuẩn không quá 5 %. Để đánh giá việc sử dụng dung môi và dung dịch mẫu trắng để dựng đường chuẩn có ảnh hưởng đến kết quả thực nghiệm (diện tích píc) hay khơng, nghiên cứu đã sử dụng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA một biến) để đánh giá. Kết quả cho thấy giá trị Pvalue tại mỗi nồng độ đều lớn hơn 0,05 chứng tỏ sự khác nhau giữa các phương sai khơng có ý nghĩa tức là các giá trị trung bình tại mỗi nồng độ được đo trong cả hai điều kiện là pha trong dung môi và dung dịch mẫu trắng là như nhau. Kết luận phương pháp không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu. Sử dụng đường chuẩn trên nền dung mơi để định lượng AO.
3.4.4 Độ chính xác của phƣơng pháp phân tích
Độ đúng và độ chụm để diễn tả độ chính xác của một phương pháp phân tích theo quan điểm của tiêu chuẩn quốc tế và tiêu chuẩn quốc gia [10].
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận.Độ chụm chỉ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình.
1. Độ chính xácđược xác định bằng cách tiến hành phân tích mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 nồng độ khác nhau: 60µg/kg; 300 µg/kg; 900 µg/kg. Thực hiện phân tích như sau: Cân khoảng 1,00 g mẫu vào ống ly tâm 50 ml, hút chính xác lần lượt 60µl, 300µl, 900 µl dung dịch chuẩn 1000 µg/kg AO bằng micropipet cho vào các ống khác nhau. Tại mỗi nồng độ thêm chuẩn thực hiện lặp lại 10 lần. Lắc xoáy nhẹ để trộn đều dung dịch thêm chuẩn vào mẫu. Tiếp tục tiến hành phân tích theo quy trình .
Tính các giá trị thống kê cho mỗi hàm lượng: độ lệch chuẩn lặp lại (Sr); độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr), hiệu suất thu hồi R (%)
Cơng thức tính tốn như sau: + Độ lệch chuẩn lặp lại
𝑆𝑟 = 𝑁 𝑥𝑖 − 𝑥 2 𝑖=1
Trong đó:
xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i
: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm N: Số lần thử nghiệm.
+ Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr)
𝑅𝑆𝐷𝑟 =𝑆𝑟
𝑥 100%
+ Hiệu suất thu hồi (R %)
𝑅 % = 𝐶𝑝𝑡
𝐶𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒 100%
Trong đó:
R: độ thu hồi (%)
𝐶𝑝𝑡: Nồng độ chất phân tích xác định trong mẫu trắng thêm chuẩn (µg/kg). Cspike : Nồng độ chất phân tích đã thêm vào mẫu trắng(µg/kg).
Kết quả phân tích tính được như sau:
Bảng 3.20. Kết quả phê duyệt độ chính xác
C Cspike Cpt Sr RSDr R(%) (%) Rtb Auramin O-60 µg/kg -1 60 52,56 55,28 2,86 5,18 87,6 92,13 Auramin O-60 µg/kg -2 54,18 90,3 Auramin O-60 µg/kg -3 55,38 92,3 Auramin O-60 µg/kg -4 54,88 91,47 Auramin O-60 µg/kg -5 53,22 88,7 Auramin O-60 µg/kg -6 56,88 94,8 Auramin O-60 µg/kg -7 52,14 86,9 Auramin O-60 µg/kg -8 61,14 101,9 Auramin O-60 µg/kg -9 53,70 89,5 Auramin O-60µg/kg -10 58,68 97,8 Auramin O-300 µg/kg -1 300 260,5 261,23 13,01 4,98 86,82 87,08 Auramin O-300 µg/kg -2 253,7 84,56 Auramin O-300 µg/kg -3 266,5 88,81 Auramin O-300 µg/kg -4 245,6 81,88 x
Auramin O-300 µg/kg -5 253,7 84,56 Auramin O-300 µg/kg -6 251,7 83,9 Auramin O-300 µg/kg -7 255 85 Auramin O-300 µg/kg -8 269,8 89,92 Auramin O-300 µg/kg -9 264,3 88,1 Auramin O-300 µg/kg - 10 291,7 97,22 Auramin O-900 µg/kg -1 900 783,2 794,29 57,19 7,2 87,03 88,25 Auramin O-900 µg/kg -2 779,5 86,61 Auramin O-900 µg/kg -3 768,7 85,41 Auramin O-900 µg/kg -4 783,2 87,03 Auramin O-900 µg/kg -5 779,5 86,61 Auramin O-900 µg/kg -6 768,7 85,41 Auramin O-900 µg/kg -7 789,8 87,75 Auramin O-900 µg/kg -8 821,3 102,37 Auramin O-900 µg/kg -9 710 78,89 Auramin O-900 µg/kg - 10 859 95,44 Trong đó:
𝐶 𝑝𝑡: Nồng độ trung bình chất phân tích xác định trong mẫu trắng thêm chuẩn sau 10 lần phân tích lặp lại (µg/kg).
Rtb: Hiệu suất thu hồi trung bình sau 10 lần phân tích lặp lại.
Từ bảng 3.20, cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) từ 4,89-7,2 % đạt theo yêu cầu độ lặp lại chấp nhận ở nồng độ từ 10µg/kg -1000µg/kg (11-21%) của AOAC, chứng tỏ phương pháp có độ chụm tốt.Độ đúng của phương pháp được đánh giá qua hiệu suất thu hồi ở mẫu thêm chuẩn ở ba mức nồng độ. Các kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi trên 80 %, chứng tỏ phương pháp có độ tin cậy và độ chính xác cao. Phương pháp có thể ứng dụng xác định hàm lượng AO trong TĂCN.
3.4.5 Ƣớc lƣợng độ không đảm bảo đo
Độ không đảm bảo đo của phép đo là thông số gắn với kết quả của phép đo, thông số này đặc trưng cho mức độ phân tán của các giá trị có thể chấp nhận được quy cho đại lượng đo của phép đo.
Các tính độ khơng đảm bảo đo theo nguyên tắc sử dụng dữ liệu xác nhận giá trị sự dụng của phương pháp [21]:
𝑈𝑐 = 𝑈𝑝𝑟𝑒𝑐2 +𝑈𝑡𝑟𝑢𝑒2
Trong đó:
𝑈𝑐: Độ khơng đảm bảo đo tổng
𝑈𝑝𝑟𝑒𝑐: ước lượng độ không đảm bảo đo của độ chụm
𝑈𝑡𝑟𝑢𝑒: ước lượng độ không đảm bảo đo của độ đúng
+ Độ không đảm bảo đo mở rộng (U) ở độ tin cậy 95 % được tính theo công thức:
𝑈 = 2𝑈𝑐
+ Độ khơng đảm bảo đo của độ chụm được tính theo cơng thức
𝑈𝑝𝑟𝑒𝑐 = 𝑆𝑟2
+ Độ không đảm bảo đo Uk của độ thu hồi R tương ứng với 3 mức nồng độ thêm chuẩn được tính theo cơng thức sau
𝑈𝑘 =𝑅 (𝑈(𝐶𝑝𝑡) 𝐶𝑝𝑡 )2 + ( 𝑈 𝐶𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒 𝐶𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒 )2 𝑈𝑡𝑟𝑢𝑒 = 𝑈𝑘2 3 𝑘=1 Trong đó:
𝑈(𝐶𝑝𝑡): là độ không đảm bảo đo chuẩn của N lần đo lặp lại
𝑈(𝐶𝑝𝑡) = 𝑆𝑟
Urecovery: là độ không đảm bảo đo của độ thu hồi 𝑈(𝐶𝑝𝑡) 𝐶𝑝𝑡 = 𝑆𝑟 𝑁 𝐶𝑝𝑡 =𝑅𝑆𝐷𝑟 𝑁
𝑈 𝐶𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒 :là độ không đảm đo của dung dịch chuẩn pha dùng để thêm
chuẩn
𝑈(𝐶𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒)
𝐶𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒 =
𝑈(𝐶1000) 1000
𝑈(𝐶1000): là độ không đảm bảo đô của dung dịch chuẩn 1000 mg/l
Ta có cơng thức tính nồng độ dung dịch chuẩn Cchuẩn (mg/l)
𝐶𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 =𝑊𝑥𝑃
𝑉 𝑥1000
Khi đó, độ khơng đảm bảo đo chuẩn tổng hợp theo công thức:
𝑈(𝐶1000) 1000 = ( 𝑈𝑤 𝑊)2 + ( 𝑈𝑝 𝑃)2 + ( 𝑈𝑉 𝑉 )2 Trong đó
𝑈𝑤: độ không đảm bảo đo chuẩn của khối lượng vật liệu
𝑈𝑃: Độ không đảm bảo đo của độ tinh khiết của chuất chuẩn
𝑈𝑉: độ không đảm bảo đochuẩn của thể tich bình định mức
+ Chứng chỉ hiệu chuẩn của cân 5 số cho biết độ không đảm bảo đo tại mức tải 0,01000 g là ± 0,03 mg với độ tin cậy khơng ít hơn 95 %. Khi đó độ khơng đảm bảo đo chuẩn của khối lượng vật liệu là Uw= 0,03/2=0,015
+ Quy định kỹ thuật của nhà sản suất với bình định mức 10 ml loại A có dung sai là ± 0,025 ml. Khi đó độ khơng đảm bảo đo chuẩn của thể tích bình định mức được tính dựa trên phân bố chữ nhật nên UV=0,025/ 3=0,014
+ Chất chuẩn Auramin O có độ tinh khiết 85 %, độ khơng đảm bảo đo của độ tinh khiết của chất chuẩn UP=15/ 3=8,66
𝑈(𝐶1000) 1000 = 0,0152 11,762 +8,662 852 +0,0142 102 = 0,102
Vậy độ không đảm bảo đo chuẩn tổng hợp của dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/kg là 0,102
Bảng 3.21. Bảng tính kết quả độ khơng đảm bảo đo của phương pháp
Chỉ tiêu phân tích Auramin O
CSpike,( µg/kg) 60 300 900 Cpt, (µg/kg) 52,56 260,46 783,24 54,18 253,68 779,46 55,38 266,45 768,72 54,88 245,64 783,24 53,22 253,68 779,46 56,88 251,70 768,72 52,14 255,00 789,78 61,14 269,76 849 53,70 264,30 709,98 58,68 291,66 858,96 Trung bình (Xtb) 55,28 261,23 787,06 Độ lệch chuẩn (Sr) 2,86 13,01 41,86 RSDr , % 5,18 4,98 5,32 Uprec , % 5,18 4,98 5,32 Recovery, % 92,13 87,08 87,45 RSD Recovery, % 5,18 4,98 5,32 U recovery , % 1,64 1,57 1,68 U(Cspike)/Cspike, % 0,10 0,10 0,10 Uk% 1,51 1,37 1,47 Uc , % 5,40 5,16 5,52 U, % 10,79 10,33 11,04 Upool, , % 10,72
Vậy độ không đảm bảo đo mở rộng của phương pháp ở mức độ tin cậy 95 % là 10,72 %
3.5 Phân tích mẫu thực tế
Sau khi đã tối ưu hóa các điều kiện phân tích AO, nghiên cứu tiến hành phân tích một số mẫu thức ăn chăn ni hồn chỉnh được sản xuất từ những công ty sản xuất TĂCN lớn tại Việt Nam được bán tại các đại lý ở khu vực Hà Nôi.
Mẫu được đồng nhất bằng máy nghiền, sau đó đem cân và tiến hành phân tích theo quy trình đã tối ưu hóa. Mỗi mẫu làm lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung bình và tính độ lệch chuẩn. Để kiểm sốt q trình phân tích, sử dụng mẫu kiểm soát (QC) là mẫu trắng thêm chuẩn. Kết quả phân tích bảng 3.22
Bảng 3.22. Kết quả phân tích mẫu thực tế
Tên công ty sản xuất Mã mẫu Kết quả phân tích
Cơng ty CP Chăn ni CP Việt Nam Mau 01 KPH
Công ty TNHH CARGILL Mau 02 KPH
Công ty CP Con heo vàng- Feed-UK Mau 03 KPH
Công ty CP dinh dưỡng Nông nghiệp Quốc tế Mau 04 KPH
Công ty CP Quốc Tế Gluck Mau 05 KPH
Công ty CP CIRAS Việt Nam Mau 06 KPH
Cơng ty CP Tập đồn DABACO Việt Nam Mau 07 KPH
Công ty CP GreenFeed Việt Nam Mau 08 KPH
Hình 3.18. Sắc đồ khơng phát hiện pic của các mẫu phân tích thực tế
Kết quả nhìn chung cho thấy, tình trạng sử dụng AO để tạo màu trong TĂCN đã được kiểm soát.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Qua quá trình khảo sát, phát triển phương pháp xác định hàm lượng AO trong TĂCN, nghiên cứu đã thu được những kết quả như sau:
1. Tối ưu hóa điều kiện phân tích trên MS/MSbằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI+) với chế độ bắn phá ion dương, kỹ thuật ghi phổ MRM đã lựa chọn được mảnh ion con dùng để định lượng là M/z=147,05; có thế phân mảnh là 44V và năng lượng va chạm là 28 V, ion con dùng để định tính là M/z= 122,08; có thể phân mảnh là 44 V, năng lượng va chạm là 24 V.
2. Tối ưu hóa điều kiện trên hệ thống UPLC với cột pha tĩnh dùng phân tích là cột C18, đường kính hạt nhồi 1,7 µm, kích thước 2,1x50 mm. Pha động kênh A là axit fomic 0,1 % trong ACN và axit fomic 0,1 % trong nước. Chế độ chạy gradient. Tốc độ dòng được lựa chọn tối ưu là 0,3 ml/phút
3. Tối ưu hóa các điều kiện chiết Auramin O ra khỏi nền mẫu: Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát đơn biến nhằm lựa chọn các điều kiện phân tích phù hợp để chiết Auramin O ra khỏi nền mẫu: Dung môi chiết là hỗn hợp dung dịch MeOH:H2O tỉ lệ 90:10; dịch chiết được làm sạch bằng cột chiết pha rắn HLB; dung môi rửa giải sau cột bằng MeOH.
4.Sau khi đã lựa chọn các thông số ảnh hưởng và khoảng biến thiên, nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình chiết mẫu theo phương pháp mặt mụctiêu (RSM) sử dụng mơ hình bậc hai tâm xoay (CCD)với 20 thí nghiệm được tiến hành theo qui hoạch thực nghiệm, dùng phương pháp đạo hàm tìm được điều kiện tối ưu để xử lý mẫu là tỉ lệ dung môi chiết là 15 ml/g, thời gian chiết30 phút, thể tích rửa giải là 4 ml. Hiệu suất thu hồi của phương pháp đạt từ 80-95 %.
5. Xác nhận giá trị sử dụng thông qua các thông số phê duyệt đạt được như sau: - Phương pháp có khoảng tuyến tính tương đối rộng, đạt từ 0,1µg/kg - 100 µg/kg . - Giới hạn phát hiện từ 10 µg/kg, giới hạn định lượng từ 33µg/kg, cho thấy phương pháp có độ nhạy cao.
- Phương pháp đáng tin cậy và độ chính xác cao với hiệu suất thu hồi đạt từ trên 80 % va độ lệch chuẩn tương đối từ 4-7,5 % cho các mức nồng độ khác nhau, đáp ứng các yêu cầu chấp nhận của AOAC.
6. Áp dụng quy trình phân tích để định lượng AO trong một số mẫu TĂCN được sản xuất từ một số cơ sở sản xuất TĂCN lớn tại Việt Nam. Kết quả phân tích đều khơng phát hiện AO. Điều này cho thấy, việc sử dụng AO làm chất tạo màu cho TĂCN đã được kiểm soát.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Thông tư số 42/2015/TT-BNNPTNT, Danh mục bổ sung hoá chất kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam. 2. Bộ Nông nghiệp và phát tiển nông thôn, (2015), Quyết định số 846/QĐ-CĐ-
TĂCN, Mở rộng phạm vi chỉ định Phịng thử nghiệm thức ăn chăn ni gia
súc, gia cầm.
3. Bộ Y tế, Quyết định số 3742 /2001/QĐ-BYT, Danh mục chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm.
4. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003),Hố
học phân tích - Phần 2: Các phương pháp phân tích cơng cụ, Nhà xuất bản
khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
5. ISO/IEC 17025:2007,Yêu cầu chung về năng lực thử nghiệm của phòng thử nghiệm.
6. Từ Vọng Nghi, Trần Chương Huyến, Phạm Luận (1990), Một số phương pháp
phân tích điện hóa hiện đại, Đại học tổng hợp Hà Nội.
7. Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Thành Trung (2015),
Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất
bản khoa học và kỹ thuật.
8. TCVN 9123:2014, Thức ăn chăn nuôi-Thuật ngữ và định nghĩa. 9. TCVN 6952:2001,Thức ăn chăn nuôi-chuẩn bị mẫu thử.
10. TCVN 6910-1-2001,Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo.
11. Nguyễn Thị Kim Thường, Phạm Tuấn Anh (2017), “Nghiên cứu xác định hàm lượng Auramin O trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan hấp thụ xung vi phân”, Tạp chí Thử nghiệm ngày nay, (1),tr. 6-10.
12. Tạ Thị Thảo, (2010), Thống kê trong hóa phân tích, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 13. Nguyễn Văn Ri,(2016), Các phương pháp tách, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tiếng Anh
14. Andre O.Beringhs, Milene Dalmina, Tania B.Creczynski-Pasa, Diva Sonaglio, (2015), “ Response Surface Methodology IV-Optimal design applied to the performance improvement of an RP-HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in Crecropia glaziovii products”, Revista Brasileira de Farmacognosia, (25), pp. 513-521
15. Association of Official Analytical Chemists (AOAC), (2016), “Appendix F: guidelines for standard method performace requirements”, AOAC oficial methods of analysis, pp.10-15
16. Chiang TL, Wang YC, Ding WH (2011), “ Trace determination of rhodamine B and rhodamine 6G dyes in aqueous samples by solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection”, Journal of the Chinese Chemical Society,(59),pp. 515-519. 17. Chiye Tatebe, Xining Zhong, Takashi Ohtsuki, Hiroki Kubota, Kyoko Sato,
and Hiroshi Akiyama (2014) , “A simple and rapid chromatographic method to determine unauthorized basic colorants (rhodamine B, auramine O, and pararosaniline) in processed foods”, Food Science Nutrition, 2(5), pp.547- 556.
18. EFSA, (2005), “Review of the toxicology of a number of dyes illegally present in food in the EU”,The EFSA Journal,(263),pp. 65-71.
19. Emna Hmani, Yousset Samet, Ridha Abdelhesdi, (2012), “ Electrochemicel degradation of Auramine O dye at boron-doped diamond and lead dioxide electrodes”, Diamond and Related Material, pp.1-8.
20. European Commisson, (2008),Regulation (EC) No 1333/2008 of the European Parliament and of the Council.
21. Eurachem, (2014), “The Fitness for Purpose of Analytical Method”, A Forcus For Analytical Chemistry in Euro,pp.19-45.
22. EuraChem/Citac Guite,(2012), Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement.
23. Feng Y, Jia L, He Y, Wang J, Liu Y, Fan X,(2013),“Simultaneous determination of 24 industrial dyes in grain and meat products by ultra performance liquid