Chất phân tích Ion mẹ (M/z) Ion con (M/z) Mục đích Điện áp mao quản (KV) Thế phân mảnh (V) Năng lượng va chạm (V) Auramin O 268,24 147,05 Định lượng 0,5 44 28 Auramin O 268,24 122,08 Định tính 0,5 44 24
Hình 3.1. Sắc đồ 3 mảnh ion con tại điều kiện tối ưu hóa trên MS/MS
Dựa vào tín hiệu píc trên hình 3.1 và hình 3.2, cho thấy mảnh ion con M/z=147,05 có tín hiệu độ nhạy cao nhất (6,26e7) nên được lựa chọn làm mảnh ion định lượng và mảnh ion con M/z=122,08 có tín hiệu thấp hơn được lựa chọn làm mảnh ion định tính.
M/z=147,02
M/z=122,05
Cơ chế phân mảnh phổ khối lượng của AO được giả định như ở hình 3.2
Hình 3.2.Cơ chế phân mảnh phổ khối của AO
Nhận xét: Tại các điều kiện tối ưu ở bảng 3.1 của hệ thống MS/MS cho tín hiệu píc ổn định và độ nhạy, độ chọn lọc cao.
3.1.2 Tối ƣu hóa các điều kiện phân tích trên hệ thống UPLC
3.1.2.1 Lựa chọn cột pha tĩnh
Nghiên cứu sử dụng hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp UPLC để thực hiện phép tách sắc ký, để khai thác các tính năng của thiết bị này nhằm tăng cường độ phân giải, phép phân tích chọn lọc hơn, cân bằng xảy ra nhanh hơn, rút ngắn thời gian phân tích cũng như đáp ứng được tính chất phân cực và cấu trúc phân tử của chất phân tích cần lựa chọn cột pha tĩnh phù hợp. Dựa vào các tài liệu tham khảo [34], [35], [60] và tính chất hóa học củaAO là chất phân cực trung bình nghiên cứu đã sử dụng cột pha tĩnh không phân cực C18(2,1x50 mm; 1,7µm) với hạt nhồi có đường kính nhỏ được chế tạo theo công nghệ polyethoxysilan, chịu được áp suất cao cũng như môi trường axit và bazơ tốt để tiến hành AO trên hệ thống UPLC.
3.1.2.2 Thành phần pha động và chế độ gradient
Về nguyên lý, phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector MS có đặc điểm giống các phương pháp LC sử dụng các detector khác. Tuy nhiên, với detector MS,
pha động cần phải có thành phần phù hợp. Đối với detector MS cùng với việc sử dụng kỹ thuật ion hóa tia điện ESI thì thành phần pha động khơng chứa các chất khó bay hơi như đệm phosphate, EDTA… và dung môi cần có sức căng bề mặt thấp để q trình phun điện tích dễ dàng ion hóa chất phân tích và bay hơi dung mơi diễn ra dễ dàng hơn [13]. Do vậy, nghiên cứu lựa chọn Acetonitril và nước cất kết hợp với 1 % axit formic để làm pha động.
Để đảm bảo chất phân tích được tách hồn tồn ra khỏi cột, góp phần tăng độ nhạy của chất và độ ổn định của phương pháp, nghiên cứu đã thực hiện khảo sátthay đổi thành phần pha động ở hai chế độ là đẳng dòng và gradient. Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 6 µg/kg để tiến hành phân tích tại các điều kiện trên HPLC: tốc độ dịng 0,3 ml/phút, cột pha tĩnh C18 (2,1x50 mm; 1,7µm) và điều kiện đã tối ưu trên hệ thống MS/MS.Quá trình thay đổi các chế độ chạy đẳng dòng pha động được thực hiện tại hai tỷ lệ khác nhau được trình bày ở bảng 3.3