Sắc đồ các chương trình 3,4,5chạy gradient

Hình 3.4. Sắc đồ các chương trình 3,4,5chạy gradient

Sắc đồ hình 3.4 cho thấy tín hiệu pic của dung dịch chuẩn 6 µg/kg khi phân tích tại các chương trình 3; 4; 5 cân xứng, nhọn đẹp. Độ nhạy của 3 píc tại 3 chương trình xấp xỉ bằng nhau điều này cho thấy tỉ lệ gradient thành phần pha động cho kết quả tương đối ổn định. Việc thay đổi thời gian gradient chỉ làm thay đổi thời gian lưu của píc.

Qua q trình khảo sát chúng tơi lựa chọn chương trình gradient 5 cho diện tích píc cao nhất, píc cân xứng và thời gian lưu ra sớm hơn chương trình 3 và 4.

3.1.2.3 Tốc độ dòng pha động

Tốc độ pha động đối với hệ UPLC ảnh hưởng nhiều đến sự ổn định của chương trình gradient, thời gian rửa giải và độ lặp lại của quá trình sắc ký. Nghiên

Chương trình 3

Chương trình 4

cứu sử dụng cột pha tĩnh có kích thước hạt nhồi rất nhỏ 1,7 µm nên tốc độ dịng lựa chọn khoảng 0,1-0,3 ml/phút để đảm bảo áp suất của tồn hệ thống khơng q cao (nhỏ hơn áp suất chịu đựng của hệ thống) và không thay đổi lớn trong suốt quá trình gradient.

Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng phù hợp được thực hiện như sau: tiến hành phân tích dung dịch chuẩn 5 µg/kg trên hệ thống UPLC-MS/MS cố định các điều kiện như điều kiện MS/MS, cột pha tĩnh, thành phần pha động đã tối ưu và thay đổi tốc độ dòng tại các mức: 0,1; 0,2; 0,3 ml/phút. Tiêm lặp lại 3 lần tại nồng độ 5 µg/kg ở mỗi tốc độ dòng tương ứng. Kết quả thu được ở bảng 3.5:

Bảng 3.5. Diện tích pic khi thay đổi tốc độ dịng

Tốc độ dòng Thời gian lƣu (phút) Diện tích pic trung bình

0,1 ml/phút 3,22 219149

0,2 ml/phút 2,14 212422

0,3 ml/phút 1,75 194324

Hình 3.6. Sắc đồ tại tốc độ dịng 0,2 ml/phút

Hình 3.7. Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút

Dựa vào kết quả của bảng thì diện tích píc tại nồng độ 5 µg/kg là tương đối bằng nhau, độ nhạy gần như khơng đổi tại ba tốc độ dịng khác nhau, tuy nhiên tại tốc độ dịng 0,3 ml/phút píc thu được tương đối cân đối hơn, giảm hiện tượng kéo đuôi, thời gian lưu ra sớm hơn so vớithời gian lưu ở hai tốc độ dòng còn lại nhưng vẫn đảm bảo được áp suất cho phép của hệ thống. Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn phân tích tại tốc độ dòng là 0,3 ml/phút.

 Điều kiện tối ưu để định lượng AO trên hệ thống UPLC như sau: + Cột pha tĩnh C18 (2,1x50 mm; 1,7 µm)

+ Pha động: Kênh A: Axit fomic 0,1 % trong ACN và kênh B Axit fomic 0,1 % trong nước. Chương trình gradient pha động số 5 (bảng 3.4)

+ Tốc độ dòng 0,3 ml/phút

+ Điều kiện MS/MS với các thông số đã tối ưu (bảng 3.1 và bảng 3.2)

3.2 Khảo sátgiới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) và khoảng tuyến tính xác định sự phụ thuộc tín hiệu đo vào nồng độ chất phân tích định sự phụ thuộc tín hiệu đo vào nồng độ chất phân tích

3.2.1 Giới hạn phát hiện thiết bị

Giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) được xác định thơng qua việc đánh giá tín hiệu nhiễu trên nền (S/N). Phân tích lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ 0,02 µg/kg trên hệ thống UPLC-MS/MS. Kết quả thu được ở bảng 3.6

Bảng 3.6. Kết quả tiêm lặp lại 6 lẫn mẫu chuẩn tại nồng độ 0,02µg/kg

Lần tiêm Diện tích Tỉ lệ S/N Nồng độ 0,02µg/kg-lần 1 822,6 2,95 Nồng độ 0,02µg/kg-lần 2 729,8 2,92 Nồng độ 0,02µg/kg-lần 3 741,7 2,95 Nồng độ 0,02µg/kg-lần 4 868,9 2,93 Nồng độ 0,02µg/kg-lần 5 784,2 2,92 Nồng độ 0,02µg/kg-lần 6 792,1 2,91

Hình 3.8. Sắc đồ tại nồng độ 0,02µg/kg

Dựa vào các kết quả phân tích cho thấy, thiết bị cho tín hiệu píc ổn đinh, cân đối tại nồng độ Auramin O là 0,02µg/kg và tỉ số tín hiệu trên nhiễu nềnxấp xỉ 3,0. Nghiên cứu lựa chọn giới hạn phát hiện thiết bị là 0,02µg/kg . Giới hạn định lượng của thiết bị IQL=3,3 IDL=0,066 µg/kg .

3.2.2 Khoảng tuyến tính

Nghiên cứu đã thực hiện đo các dd chuẩn trên nền mẫu có nồng độ thay đổi từ 0,07µg/kg đến 100 µg/kg và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu đo vào nồng độ để xác định khoảng tuyến tính.

Hình 3.9. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Auramin O

Kết quả cho thấy, sự phụ thuộc của tín hiệu đo vào nồng độ có quan hệ tuyến tính trong khoảng từ 0,07µg/kg đến 100 µg/kg .

y = 31513x + 32328 R² = 0.998 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 0 20 40 60 80 100 120 D iê n tích p ic Cchuan (µg/kg )

3.3 Tối ƣu hóa phƣơng pháp chiết Auramin O ra khỏi nền mẫu

3.3.1 Khảo sát đơn biến để chọn các thông số ảnh hƣởng và khoảng biến thiên

3.3.1.1 Lựa chọn dung môi chiết

Lựa chọn dung môi chiết tách là một bước quan trọng trong việc xác định chính xác hàm lượng chất phân tích các nền mẫu. Dung môi được chọn là dung môi chiết cho hệ số thu hồi lớn nhất với sự ảnh hưởng của chất gây nhiễu là thấp nhất. Dựa theo các tài liệu tham khảo [23],[28], [43], [50], [55], [60], [56]…chúng tôi đã tiến hành khảo sát chiết bằng ba hệ dung môi khác nhau là MeOH, ACN, Ethanol trên nền mẫu trắng thêm chuẩn 100 µg/kg.Cân khoảng 1,00 g mẫu trắng, hút chính xác 100 µl dung dịch chuẩn 1000 µg/kg . Đậy nắp và lắc xoáy nhẹ. Thêm 15 ml dung dịch chiết. Lắc xoáy và lắc trong 30 phút. Lọc lấy dịch. Lọc qua màng lọc 0,22 µm. Phân tích trên hệ thống sắc ký.Mỗi loại dung mơi chiết thực hiện 3 lần lặp lại.

Kết quả sau khi khảo sát cho độ thu hồi đối với từng loại dung môi như ở bảng 3.7

Bảng 3.7. Hiệu suấtthu hồi khi sử dụng ba loại dung môi chiết

Loại dung môi chiết Hiệu suất thu hồi trung bình

Methanol 80,2 %

Acetonitril 55,1 %

Ethanol 78,4 %

Dựa vào độ thu hồi chất phân tích khi sử dụng ba loại dung môi chiết khác nhau, cho thấy chiết bằng methanol đạt được hiệu suất cao nhất, khoảng 80,2 %. Tuy nhiên, để tiếp tục cải thiện khả năng hồ tan AO vào dung mơi chiết nhằm tăng hiệu suất thu hồi, nghiên cứu đã tiến hành thêm nước vào dung môi chiết ở tỉ lệ MeOH:H2O là 90:10.Kết quả phân tích trên ba lần lặp lại đối với mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 100 ng/l cho hiệu suất thu hồi tăng lên đáng kể 87,3 %, nghiên cứu lựa chọn sử dụng hỗn hợp dung môi chiết này để chiết AO ra khỏi nền mẫu TĂCN.

3.3.1.2 Lựa chọn cột chiết pha rắn để làm sạch tạp chất

Dựa vào cơng thức cấu tạo của AO vừa có nhóm kỵ nước- khơng phân cực (phenyl) vừa có nhóm ưa nước-phân cực (amin), chúng tôi lựa cột chiết pha rắn C18 và cột HLB để loại tạp chất. Quá trình thực hiện: Cân khoảng 1,00 g mẫu trắng, hút chính xác 100 µl dung dịch chuẩn 1000 µg/kg . Đậy nắp và lắc xoáy nhẹ. Thêm 15 ml dung dịch chiết. Lắc xoáy và lắc trong 30 phút. Lọc lấy dịch. Tiếp tục thực hiện chiết pha rắn trên cột C18 và cột HLB, mỗi loại cột thực hiện lặp lại 3 lần. Lọc dịch rửa giải qua màng lọc 0,22 µm. Phân tích trên hệ thống sắc ký.

Quá trình chiết pha rắn thực hiện như sau:

Tốc độ dòng chảy trong chiết pha rắn được khống chế bằng bộ bơm hút chân không, sao cho tốc độ dịng đạt khoảng 1 ml/phút.

- Hoạt hố cột:Thêm lần lượt 3 ml MeOH, 3 ml nước cất qua cột - Nạp chất phân tích lên cột:

Các nghiên cứu cho thấy, khi pha loãng dịch chiết với nước để tránh ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến cột chiết[16]. Để đánh giá sự ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến cột chiết như đã đề cập. Nghiên cứu đã tiến hành nạp 5 ml dịch chiết khơng pha lỗng qua cột chiết và hiệu suất thu hồi chỉ đạt khoảng từ 24-25 % đối với cả hai loại cột C18 và HLB. Kết quả này cho thấy dung mơi hữu cơ có ảnh hưởng khơng nhỏ đến cột chiết pha rắn, làm giảm khả năng lưu giữ của chất phân tích trên cột dẫn đến hiệu suất thu hồi giảm.

Chuyển toàn bộ hỗn hợp dung dịch gồm 1,00 ml dịch chiết AO pha loãng với 4 ml nước cho qua cột.

Cơ chế hấp phụ xảy ra như sau: AO sau khi được đưa vào cột sẽ được hấp thu lên bề mặt vật liệu nhồi nhờ các lực liên kết như lực Van dal van, liên kết phân cực với nhóm chức trong chất nhồi cột.

- Rửa tạp chất: Thêm 2 ml dung dịch MeOH: H2O tỉ lệ 20:80. Hút khô cột sau khi hết dịch chảy qua cột.

- Rửa giải: Thêm chính xác 5,00 ml MeOH qua cột. Hút khơ cột sau khi hết dịch chảy qua cột.

Hiệu suất thu hồi mẫu trắng thêm chuẩn 100 µg/kg sau khi chiết pha rắn bằng cột C18 và HLB được trình bày ở bảng 3.10

Bảng 3.8. Hiệu suất thu hồi khảo sát trên cột chiết pha rắn

Loại cột chiết pha rắn Hiệu suất thu hồi trung bình sau 3 lần lặp lại (%)

C18 87,73

HLB 89,12

Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi thu được khi sử dụng cột chiết pha rắn C18 và HLB tương đương nhau, tuy nhiên,các tài liệu tham khảo nhận định cột chiết pha rắn có chứa hạt chất nhồi styrene-divinylbenzene polymeric có khả năng lưu giữ tốt AO [17]. Theo đó, chúng tơi cũng dựa trên tính chất phân cực và ưa nước của AO đã lựa cột HLB có chứa nhóm chất vừa ưa nước vừa ưa dầu N- vinylpyrrolidone-divinylbenzene để làm sạch tạp chất.

Hình 3.10. Cơng thức cấu tạo của chất tạo hạt nhồi trong cột HLB

Trong đó:

Hydrophobic Group : nhóm kỵ nước-Styrene Hydrophilic Group: nhóm ưa nước-divinylbenzen

3.3.1.3 Lựa chọn dung môi rửa giải

Dung môi rửa giải tốt làm tăng tính chọn lọc phương pháp và phù hợp với thiết bị phân tích. AO là chất phân cực nên nghiên cứu lựa chọn MeOH là dung mơi rửa giải.Để có được một tỉ lệ MeOH phù hợp đối với việc rửa giải AO hoàn toàn ra khỏi cột, nghiên cứu đã tiến hành khảo sát rửa giải ở các tỉ lệ dung môi khác nhau

đối với mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 100 µg/kg, kết quả phân tích trung bình sau ba lần lặp lại như bảng 3.9

Bảng 3.9. Hiệu suất thu hồi ở các tỉ lệ dung môi rửa giải khác nhau

Hỗn hợp dung môi Tỉ lệ dung môi (%) Hiệu suất thu hồi (%)

MeOH: H2O 20:80 Không thu hồi

MeOH: H2O 50:50 Không thu hồi

MeOH 100 86,4 %

Dựa vào kết quả hiệu suất thu hồi AO sau khi chiết qua cột, nhận thấy sử dụng 100 % MeOH để rửa giải AO ra khỏi cột HLB là tốt nhất. Có thể sử dụng hỗn hợp dung mơi MeOH và H2O tỉ lệ 20:80 để rửa tạp mà không làm mất chất phân tích.

3.3.2 Tối ƣu hóa điều kiện xử lý mẫu vớipp mặt mục tiêu tâm xoay (RSM)

Sau khi đã lựa chọn dung môi và cột chiết pha rắn phù hợp, nghiên cứu tiến hành tối ưu hóa q trình xử lý mẫu sử dụng phương pháp mặt mục tiêu tâm xoay để tìm điều kiện tối ưu cũng như đánh giá sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình xử lý mẫu. Ba yếu tố được đánh giá ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi là tỉ lệ thể tích dung mơi và khối lượng mẫu, thời gian chiết, thể tích dung mơi rửa giải sau cột. Thể tích dung mơi chiết cần phải đủ để chiết hồn tồn chất phân tích trong một lượng mẫu tương ứng. Nếu thể tích dung mơi q ít thì sẽ khơng hịa tan triệt để chất phân tích có trong mẫu, nhưng nếu nhiều sẽ gây lãng phí và ảnh hưởng đến môi trường. Nghiên cứu đã tiến hành tối ưu tỉ lệ dung môi chiết trong khoảng từ 5 ml đến 15 ml trên 1 gam mẫu phân tích.

Thời gian chiết cần phù hợp đối với từng đối tượng mẫu. Tùy thuộc vào tính chất liên kết của chất phân tích trong nền mẫu có bền chặt hay khơng, thời gian chiết phải đủ lâu để có thể hịa tan hồn tồn vào dung mơi chiết. AO trong nền mẫu TĂCN tồn tại ở dạng tự do vì chỉ được bổ sung để tạo màu nên nghiên cứu đã lựa chọn mức khảo sát trong khoảng thời gian từ 5 đến 20 phút.

Hiệu suất thu hồi sẽ giảm nếu chất phân tích khơng được rửa giải hồn toàn trong cột chiết pha rắn. Điều này phụ thuộc vào việc lựa chọn dung môi rửa giải với lượng thể tích phù hợp. Để tối ưu hóa lượng dung mơi phù hợp cho q trình rửa giải chất phân tích qua cột, nghiên cứu đã tiến hành khảo sát trong khoảng thể tích từ 2 đến 5 ml.

Khoảng biến thiên các yếu tố cần khảo sát được thể hiện ở bảng 3.10

Bảng 3.10. Khoảng biến thiên của các yếu tố cần khảo sát

Phương trình bậc 2 thể hiện mối quan hệ giữa tín hiệu phân tích và các yếu tố cần khảo sát như sau:

Y=b0 + b1Vc/m + b2T + b3Vrg+ b1,1(Vc/m)2 + b2,2T2 + b3,3Vrg2 + b1,2(Vc/m)xT + b1,3(Vc/m)*Vrg+ b2,3T*Vrg +b1,2,3(Vc/m)xT*Vrg

Trong đó b0 đặc trưng cho phần tín hi ệu nhiễu của mơ hình , các hệ sớ bi, bi,jvà bi,i là hệ số đặc trưng cho chiều hướng và mức đ ộ ảnh hưởng bậc một, bậc hai của các ́u tớ đến tín hiệu phân tích.

Sử dụng phần mềm MINITAB 16 để thiết lập bảng qui hoạch thực nghiệm (Bảng 3.11) với các điều kiện như trên và tiến hành các thí nghiệm theo bảng này. Tổng số thí nghiệm cần phải tiến hành theo mơ hình là N=20, trong đó số thí nghiệm tại điểm* là N*=6, số thí nghiệm ở tâm N0=6, số thí nghiệm tại điểm gốc Ngốc=8, khoảng cách từ tâm đến điểm * là d=2(n-q)/4=1,682 (số yếu tố n=3 và số yếu tố rút gọn q=0).

Yếu tố Ký

hiệu

Mức

thấp Mức cao Khoảng biến thiên

Tỉ lệ V dung môi và khối

lượng mẫu (ml/g) Vc/m 5 15 10

Thời gian chiết (phút) T 10 30 20

Thể tích dung mơi rửa

Mẫu được sử dụng khảo sát là mẫu trắng thêm chuẩn tại nồng độ 100 µg/kg. Kết quả hiệu suất thu hồi đạt được khi tiến hành thay đổi đồng thời các yếu tố ở bảng 3.10

Bảng 3.11. Kết quả thí nghiệm tiến hành theo mơ hình bậc 2 tâm xoay

STT Thứ tự thực nghiệm Loại điểm Vc/m T Vrg Độ thu hồi của mẫu (%) 7 1 1 5 30 5,0 69,32 17 2 0 10 20 3,5 81,11 12 3 -1 10 30 3,5 83,15 8 4 1 15 30 5,0 87,00 16 5 0 10 20 3,5 83,20 4 6 1 15 30 2,0 87,13 6 7 1 15 10 5,0 81,00 10 8 -1 15 20 3,5 82,47 2 9 1 15 10 2,0 84,82 1 10 1 5 10 2,0 71,62 11 11 -1 10 10 3,5 79,00 14 12 -1 10 20 5,0 81,90 5 13 1 5 10 5,0 64,30 19 14 0 10 20 3,5 82,14 9 15 -1 5 20 3,5 73,40 18 16 0 10 20 3,5 84,01 20 17 0 10 20 3,5 80,85 15 18 0 10 20 3,5 83,60 13 19 -1 10 20 2,0 80,4 3 20 1 5 30 2,0 71,6

Xử lý số liệu trên phần mềm MINITAB 16 với các dữ liệu thực nghiệm thu được ở trên cho kết quả như ở bảng 3.11 và bảng 3.12

Bảng 3.12. Bảng hệ số thực của phương trình hồi quy

Số hạng Hệ số Sai số T P Hằng số 55,42 7,340 7,551 0,000 Vc/m 4,03 1,050 3,844 0,003 T 1,74 0,523 2,790 0,019 Vrg -1,27 3,947 -0,323 0,753 Vc/m * Vc/m -0,15 0,047 -3,253 0,009 T*T -0,0072 0,0118 -0,604 0,559 Vrg * Vrg -0,2747 0,528 -0,520 0,614 Vc/m *T 0,0082 0,013 0,592 0,567 Vc/m*Vrg 0,095 0,092 1,022 0,331 T*Vrg 0,0725 0,046 1,560 0,150

Độ lệch chuẩn S= 1,97Hệ số tương quan R =94,68 % và R2=89,90 %

Như vậy,bằng phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm mơ hình bậc hai tâm xoay đã tìm được mơ hình mơ tả giá trị hàm lượng AO khi phân tích mẫu TĂCN phụ thuộc các yếu tố như sau:

Y =55,426 + 4,03Vc/m +1,74T -1,27Vrg -1,54(Vc/m)2 -0,007 T2 - 0,27 Vrg2+0,008(Vc/m)*T + 0,007T*Vrg+0,095Vc/m*Vrg

Từ bảng 3.12, nhận thấy giá trị hồi qui với độ tin cậy 95% thì hiệu suất thu hồi bị ảnh hưởng bởi các yếu tố là tỉ lệ thể tích chiết và khối lượng mẫu phân tích, thời gian chiết và ảnh hưởng bậc hai tỉ lệ thể tích chiết và khối lượng mẫu phân