Chuột nhắt trắng Mus musculus (chủng Swiss) cả giống đực-cái, có trọng lượng 18-22 gam đảm bảo sinh lý khỏe mạnh, đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu, được mua tại Viện Vệ sinh dịch tễ.
Hàng ngày chuột được nuôi bằng thức ăn tổng hợp doViện Vệ sinh dịch tễ cung cấp. Chế độ quang chu kỳ: 12 giờ sáng, 12 giờ tối.
Đối với chuột được lấy máu xét nghiệm, lấy hết thức ăn khỏi trước 6 giờ lấy máu xét nghiệm.
2.2. Vật liệu. 2.2.1. Hóa chất. 2.2.1. Hóa chất.
Ethanol 96o, NaCl 0,9% (dung dịch tiêm truyền), Tris-HCl, đệm kali phosphate, ethyl acetoacetate, methanol, axit acetic, nước cất.
Alloxan monohydrate, 5-ALA mua của hãng Sigma. Thuốc đối chứng Gliclazide (80mg) xuất sứ Việt Nam.
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu.
Máy đo đường huyết tự động GLUCARD ∑ GT-1070 của công ty tập đồn ARKRAY, bộ kít thử GLUCARD ∑ của cơng ty tập đồn ARKRAY của Hàn Quốc.
Máy khuấy từ, máy chạy sắc ký HPLC, máy gia nhiệt, máy đông khô, thiết bị chuẩn pH, máy khuấy từ và các dụng cụ thông thường khác như ống eppendorf, ống falcon,…
2.3. Phƣơng pháp
2.3.1. Phƣơng pháp tạo mẫu khô từ dịch chiết lá ổi [16,20]
Bước 1. 5g lá ổi tươi được rửa sạch.
Bước 2. Được ủ trong 3 ml 5% HClO4 sau đó được siêu âm trong 1h. Bước 3. Mẫu được ly tâm trong 10 phút ở 16000 vòng/phút thu dịch nổi. Bước 4. Dịch nổi được cho thêm KOH về pH 4,5 và để qua đêm.
Bước 5. Ly tâm thu dịch. Dịch thu được cho vào đông khô và thu mẫu. Bước 6. Cho lên cột DOWEX-50W-X8 thu phân đoạn.
2.3.2. Phƣơng pháp thử độc tính cấp của dịch chiết lá Ổi.
Thử độc tính cấp được tiến hành trên chuột. Chuột nhịn đói 16 giờ trước khi đo hàm lượng glucose trong máu của chuột. Chuột được cho uống dịch chiết với hàm lượng 400 mg/kg. Thử độc tính cấp được tiến hành trong vòng 7 ngày.
2.3.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 2.3.3.1. Giới thiệu phƣơng pháp.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang chất rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy [18].
Hình 2.1:Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử).
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường...[18]
2.3.3.2. Nguyên lý tiến hành.
Chuẩn bị dụng cụ và máy móc:
Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy hoạt động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung mơi, tốc độ dịng, năng lượng đèn… Đúng theo yêu cài thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra. Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc ký [18].
Chuẩn bị dung môi pha động:
Các dung môi cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC. Pha dung mơi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu. Lọc dung mơi qua màng lọc 0,2-0,45µm, siêu âm
Chuẩn bị mẫu đo HPLC:
Mẫu thử: Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, quy trình theo nguyên tắc: - Dung mơi hịa tan hoạt chất phải hoàn trong pha động.Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 µm.Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột.
- Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng một dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngồi ra có thể dung nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.
Cách đo HPLC:
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc [18] sau:
- Chạy máy với dung mơi pha động để đuổi bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột.
- Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như sau: Cấu hình máy.
Tỷ lệ các dung mơi pha động.
Bước sóng, thành phần mẫu, các thơng số của q trình phân tích u cầu.
2.3.3.3. Phƣơng pháp đánh giá định tính và định lƣợng 5-ALA bằng HPLC
Các mẫu và hóa chất cần chuẩn bị
Mẫu gồm:
- Dịch chiết tổng số lá ổi tươi.
Phương pháp tiến hành
Bước 1: Pha dung môiacetylacetone gồm những thành phần theo tỷ lệ là acetylacetone: ethanol: H2O= 3 :2:15. Pha dung môi formaldehyde (10 %)
Bước 2: Hòa dung dịch acetylacetone 3,5 mL với 50µl mẫu và 0.45 mL formaldehyde (10 %) được làm nóng 100°C trong 10 phút. Sau đó làm mát bằng đá và đưa mẫu lên cột
Bước 3: Tiến hành cài đặt chạy máy HPLC với tốc độ dòng chảy là 0,7 ml/phút.Dung dịch rửa giải là methanol: nước cất: acetic axit (500:500:10). Cường độ huỳnh quang của rửa giải được cài đặt ở bước sóng 250 nm [26].
2.3.4. Đánh giá hoạt tính của 5-ALA trên mơ hình bệnh tiểu đƣờng ở chuột
2.3.4.1. Mơ tả gây bệnh tiểu đƣờng trên chuột.
Các nhóm được tiêm alloxan monohydrate liều 160 mg/kg vào màng bụng trừ nhóm 1 sau 72h, đo lượng glucose trong máu ≥ 7mmol/l thì tiến hành thí nghiệm.[17].
2.3.4.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng điều trị tiểu đƣờng bằng 5-ALA
Sau khi được bắt về chuột được nuôi ổn định glucose trong máu ở điều kiện phịng thí nghiệm 3-4 ngày. Sau đó được chia làm 6 nhóm mỗi nhóm 3 con và chuột được gây tiểu đường bằng cách tiêm vào màng bụng alloxan monohydrate liều duy nhất 160 mg/kg pha trong dung dịch NaCl 0,9% (nước muối sinh lý)[23,26,29].
Thí nghiệm đƣợc thiết kế nhƣ sau:
Để đánh giá điều trị tiểu đường bằng 5-ALA chuột sẽ đươc chia thành 5 nhóm như sau:
- Nhóm 1: đối chứng sinh học
- Nhóm 3: được điều trịvới Gliclazide liều 19,2mg/kg. - Nhóm 4: được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg - Nhóm 5: được điều trị với 5-ALA liều 150mg/kg - Nhóm 6: được điều trị với 5-ALA liều 200mg/kg
Các nhóm được tiêm alloxan monohydrate liều 160 mg/kg vào màng bụng trừ nhóm 1 sau 72h, đo lượng glucose trong máu ≥ 7mmol/l thì tiến hành thí nghiệm. Chuộtđược sau khi bỏ đói qua đêm.Cứ 5 ngày sẽ đo kiểm tra 1 lần, thí nghiệm trong 21 ngày.
2.3.5. Phƣơng pháp định lƣợng Glucose trong máu 2.3.5.1. Nguyên lý hoạt động:
Nguyên tắc hoạt động của phương pháp dựa trên chuỗi phản ứng tạo màu và được đo bằng phương pháp đo quang học để định lượng glucose trong máu.
Xúc tác đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kít thử, glucose trong máu phản ứng với oxy (O2) khơng khí trong máu tạo thành axit gluconic và hydro peroxide (H2O2).
Hydro peroxide tiếp tục phản ứng với O-Dianisidin tạo phức màu và được thiết bị đo quang học trong máy chuyển hóa định lượng biểu thị bằng số mmol/l.
Định lượng glucose trong máu của chuột bằng cách trích máu bằng kim có trong bộ kít thử, lấy kít thử gắn với máy đo glucose trong máu tự động, rồi chấm 1 giọt vào kít thử. Sau 7 giây, ghi nhận kết quả nồng độ glucose trong máu (mmol/l). Chỉ số glucose trong máu được đo bằng máy đo glucose trong máu tự động và bộ kít thử GLUCOCARD ∑ của Hãng ARKRAY của Nhật Bản [31].
2.3.6. Phƣơng pháp định lƣợng Insulin và HbA1c trong máu. 2.3.6.1. Nguyên lý hoạt động:
Dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên kháng thể nên định lượng insulin và HbA1c trong máu bằng phương pháp ELISA.
- Pha loãng kháng nguyên (250 ng/ml trong đệm Carbonate/giếng), ủ qua đêm, nhiệt độ 4ºC.
- Rửa 3 lần bằng đệm Washing (phosphate-buffered saline –PBS có bổ sung 0,05% Tween 20, 200 µl/giếng).
- Ủ các giếng với 100 µl đệm assay (PBS + 10% FBS) trong 1 giờ, nhiệt độ phòng.
- Rửa đĩa 3 lần bằng đệm Washing (phosphate-buffered saline –PBS có bổ sung 0,05% Tween 20 và 1% sữa tách béo, 200 µl/giếng).
- Tiếp tục bổ sung 100 µl huyết thanh của các lơ chuột trước và sau khi làm thí nghiệm, ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phịng.
- Tiếp tục rửa 5 lần bằng đệm Washing (như trên)
- Bổ sung thêm Goat-Antimouse IgG có gắn HRP (Promega cat W4021) tỉ lệ 1/2500, ủ trong 1 giờ, nhiệt độ phòng.
- Tiếp tục rửa 5 lần bằng đệm Washing (như trên).
- Bổ sung thêm 100 µl/giếng đệm phát hiện màu ủ 30 phút trong bóng tối, 37ºC.
- Dừng phản ứng bằng 50 µl/giếng H2SO4. - Đo bước sóng ở 450 nm bằng thiết bị ELISA.
2.3.7. Phƣơng pháp xét nghiệm các chỉ số men gan. 2.3.7.1. Nguyên tắc
Chỉ số GOT, GPT
tế bào mới sinh ra. Khi những tế bào gan chết đi thì enzyme trong tế bào đó sẽ được giải phóng vào máu. Như vậy, trong máu luôn tồn tại một lượng enzymenhất định.
Khi một hoặc nhiều hơn một trong số các enzyme này có giá trị cao hơn giá trị bình thường, thì bạn sẽ được giải thích là “enzyme gan cao”. Có nghĩa là vì một số ngun nhân nào đó, lượng enzyme được giải phóng vào máu nhiều hơn bình thường phản ánh một tình trạng các tế bào gan đang bị hủy hoại. Chỉ số enzyme gan càng cao hơn bình thường đánh giá tình trạng tổn thương nhu mô gan càng nhiều.
GOT, GPT là 2 enzyme trao đổi amin (transaminase). Chúng xúc tác các phản ứng trao đổi amin sau:
Aspartat + α-cetoglutarat<=(GOT)=>Glutamat + Oxaloacetat Alanin+= α-cetoglutarat<=(GPT)=>Glutamat + Pyruvat
Xác định hoạt độ GOT, GPT cho phép đánh giá mức độ tổn thương (hủy hoại) tế bào nhu mô gan.
Hoạt độ GOT, GPT xác định (Theo khuyến cáo của IFCC- Tổ chức Hóa lâm sàng Quốc tế = International Federation Clinical Chemitry) dựa trên các phản ứngsau:
Với GOT
α- cetoglutarat + Aspatat <= (GOT) => Glutamat + Oxaloacetat Oxaloacetat + NADH + H+<= (MDH) => Malat + NAD+.
Với GPT
Alanin+α-cetoglutarat<=(GPT)=>Glutamat + Pyruvat Pyruvat + NADH + H+<= (LDH) =>L-lactate + NAD+
LDH là lactate dehydrogenase, MDH là malatdehydrogenase, đo độ giảm NADH ở bước sóng 340 nm, từ đó tính được hoạt độ enzyme.
Trị số GOT=OD340/ phútx1745 Trị số GPT=OD340/ phútx1745 Chỉ số Bilirubin
Bilirubin là một trong những sản phẩm thối hóa của hemoglobin hình thành khi các tế bào máu chết. Bilirubin tồn tại dưới dạng khơng hịa tan (còn gọi Bilirubin gián tiếp), hoặc hòa tan, liên hợp (gọi là Bilirubin trực tiếp). Bilirubin liên hợp được tạo ra ở gan và di chuyển đến túi mật. Khi được kích thích bằng cách ăn uống, mật (bao gồm cả Bilirubin liên hợp) được bài tiết vào ruột non và được thải ra ngoài. Bilirubinis một chỉ số chẩn đốn quan trọng. Mức độ Bilirubin cao có thể dẫn đến vàng da và có thể bệnh lý của gan, rối loạn máu, hoặc tắc nghẽn đường mật.
Sử dụng các phản ứng của Bilirubin với axit sulfanilic tạo ra một sản phẩm đo màu đo tại bước sóng 530 nm, tương ứng với Bilirubin trình bày trong mẫu.
Nồng độ Bilirubin được xác định theo công thức 𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑏𝑖𝑙𝑖𝑟𝑢𝑏𝑖𝑛 = 𝐴530 𝑚ẫ𝑢 − 𝐴530 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘
𝐴530 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑡𝑜𝑟 − 𝐴530 𝑛ướ𝑐× (5mg/dL) Trong đó:
(A530) mẫu = Giá trị của mẫu
(A530) blank = Giá trị của mẫu trống (A530) calibrator = Giá trị của calibrator (A530) nước = Giá trị của kiểm soát nước
5 mg/dL = nồng độ Bilirubin tương đương với calibrator khi xét nghiệm
Chỉ số ALP
Alkalinephosphatase(ALP)là một loại enzymeđượctìmthấytrong các mơkhắp cơ thể,baogồmcảgan, xương,thận,ruột, vàtrongnhau thai củanhững phụ nữđang mang thai.Tuy nhiên,ALPcó nhiều nhấttrongcác tế
bàotạothànhốngdẫnmật(ốngnhỏdẫnmật từ ganxuốngruột),ở ruộtnógiúp tiêu hóachất béotừ thức ăn.ALPtrongxươngđược sản xuấtbởi các tế bàođặc biệt gọi là“nguyên bào xương”có liên quan đếnsự hình thành của xương.Mỗiloạimơ khác nhausảnxuấtcácdạng ALPkhácnhauđược gọi làisoenzymes.
Hàm lượng caocủaALPtrong máunguyên nhânphổ biếnnhất làbệnhganhoặc rối looãng xương.Nồngđộcác enzymecó thể đượctăng lên rất nhiều, trongtrường hợpmột hoặc nhiềuống dẫn mậtbịtắc nghẽn.Nồng độ trong máutăngíthơnđược nhìn thấy trongung thưganvà xơ gan,sử dụngthuốcgây độc chogan,vàviêm gan.
Phương pháp xác định hoạt động (ALP) dựa trên phản ứng:
Tại pH của phản ứng 4-nitrophenoxide có màu vàng đậm. Phản ứng được theo dõi bằng cách đo tốc độ gia tăng hấp thụ ở bước sóng 405 nm mặt khác chúng tỷ lệ thuận với hoạt động của ALP trong huyết thanh.
Trị số ALP=OD405/phút × 1745
2.3.7.2. Xác định chỉ số GOT, GPT, ALP và Bilirubin.
Chuột được cho nhịn ăn quađêm và sau đó chia thành 6 nhóm như trên. Sau đó các nhóm được tiêm alloxan monohydrate trừ nhóm 1. Sau đó nhóm 3,4,5,6 đều được uống Gliclazide và 5-ALA theo liều lượng ở trên. Tất cả chuột đã bị giết sau 21 ngày khi tiêm alloxan monohydrate, toàn bộ máu đã được lấy ra từ động mạch cảnh và huyết thanh được tách ra để xét nghiệm. Mô gan đã được gỡ bỏ, và sau đó phần gan được lấy từ mỗi thùy của gan được cố định trong dung di ̣ch Bouin.
Đối với GOT, GPT
1ml BUF được pha với 0,25ml SUB và 0,1ml huyết thanh. Ủ ở 37C trong 1 phút. Sau đó được đo ở bước sóng 340nm và đọc kết quả. Phút thứ 2 đo lại 1 lần nữa.
Đối với Bilirubin
Bảng 2.1: Công thức pha đệm đo Bilirubin
A B C Muối H2O Mẫu
OD mẫu 200l 80l 520l - - 200l
OD blank 200l - - 520l 80l -
OD nước - - - - 200l -
OD calibrator 200l dung dịch calibrator
Mẫu được pha theo tỉ lệ trên ủ trong 10 phút và đo ở bước sóng 530nm. Đọc kết quả.
Đối với ALP
1ml thuốc thử pha với 20l mẫu sau đó được ủ 1 phút ở 37C và đo. Phút thứ 2 tiếp tục được đo lại và đọc kết quả.
2.3.8. Phƣơng pháp làm tiêu bản gan, thận, tụy chuột 2.3.8.1. Nguyên tắc
Muốn quan sát kính hiển vi một mơ gan thì phải cắt mỏng. Thế nên phải chuyển chúng về trạng thái rắn thì chúng khơng bị biến đổi hình dạng và giữ được đúng trạng thái lúc chết. Dung di ̣ch Bouin c ố định mẫu giữ nguyên trạng thái của mẫu, xylen dung dịch đệm chuyển giữa nước và parafin. Parafin chuyển trạng thái rắn ở nhiệt độ thường và có độ dẻo nhất định giúp cắt mẫu dễ dàng không bị vỡ mẫu. Nhuộm Hematoxylin, Eosin giúp quan sát mẫu dễ dàng hơn.
2.3.8.2. Quy trình thí nghiệm
Bước 1: Rửa mẫu
- Mẫu được lấy từ dung di ̣ch Bouin được rửa nước qua đêm. Bước 2: Chuyển đệm
- Mẫu được ngâm lần lượt các dung dịch cồn 70, 80, 90, 96 trong 45 phút mỗi dung dịch. Sau đo tiếp tục ngâm trong cồn 100, xylen-cồn, xylen 1, xylen 2 trong 1 giờ mỗi dung dịch.
Bước 3: Tẩm paraffin
- Mẫu tiếp tục được ngâm trong xylen-parafin ở 37C qua đêm.
- Mẫu được chuyển sang ngâm trong parafin 1 trong 5 giờ, parafin 2trong 6 giờ ở 60C.
Bước 4: Đúc mẫu
- Các mẫu khác nhau được chia vào các giếng trong đĩa elisa 24 giếng chú ý đặt mẫu thẳng và chính giữa giếng. Để qua đêm để mẫu khơ và đông.
Bước 5: Cắt mẫu và gắn lên lam kính
- Cắt lát dày 7-15µm bằng máy cắt mô học. - Thả lát cắt mẫu vào 1 bát nước ấm: 60-70C. - Lên lam.
Bơi albumin lên lam kính (gắn mẫu dễ dàng hơn , giữ mẫu trong các bước rửa tiếp theo). Không bôi quá nhiều vì khi nhuô ̣m mẫu sẽ bắt màu đâ ̣m.
Hơ lam kính trên ngo ̣n lửa đèn cờn cho khơ albumin, vớt lát cắt lên lam