Xác định chỉ số GOT, GPT, ALP và Bilirubin- 123docz.net

2.3.3.3 .Phương pháp đánh giá định tính và định lượng 5-ALA bằng HPLC

2.3.7.2. Xác định chỉ số GOT, GPT, ALP và Bilirubin

Chuột được cho nhịn ăn quađêm và sau đó chia thành 6 nhóm như trên. Sau đó các nhóm được tiêm alloxan monohydrate trừ nhóm 1. Sau đó nhóm 3,4,5,6 đều được uống Gliclazide và 5-ALA theo liều lượng ở trên. Tất cả chuột đã bị giết sau 21 ngày khi tiêm alloxan monohydrate, toàn bộ máu đã được lấy ra từ động mạch cảnh và huyết thanh được tách ra để xét nghiệm. Mô gan đã được gỡ bỏ, và sau đó phần gan được lấy từ mỗi thùy của gan được cố định trong dung di ̣ch Bouin.

 Đối với GOT, GPT

1ml BUF được pha với 0,25ml SUB và 0,1ml huyết thanh. Ủ ở 37C trong 1 phút. Sau đó được đo ở bước sóng 340nm và đọc kết quả. Phút thứ 2 đo lại 1 lần nữa.

 Đối với Bilirubin

Bảng 2.1: Công thức pha đệm đo Bilirubin

A B C Muối H2O Mẫu

OD mẫu 200l 80l 520l - - 200l

OD blank 200l - - 520l 80l -

OD nước - - - - 200l -

OD calibrator 200l dung dịch calibrator

Mẫu được pha theo tỉ lệ trên ủ trong 10 phút và đo ở bước sóng 530nm. Đọc kết quả.

 Đối với ALP

1ml thuốc thử pha với 20l mẫu sau đó được ủ 1 phút ở 37C và đo. Phút thứ 2 tiếp tục được đo lại và đọc kết quả.

2.3.8. Phƣơng pháp làm tiêu bản gan, thận, tụy chuột 2.3.8.1. Nguyên tắc

Muốn quan sát kính hiển vi một mơ gan thì phải cắt mỏng. Thế nên phải chuyển chúng về trạng thái rắn thì chúng khơng bị biến đổi hình dạng và giữ được đúng trạng thái lúc chết. Dung di ̣ch Bouin c ố định mẫu giữ nguyên trạng thái của mẫu, xylen dung dịch đệm chuyển giữa nước và parafin. Parafin chuyển trạng thái rắn ở nhiệt độ thường và có độ dẻo nhất định giúp cắt mẫu dễ dàng không bị vỡ mẫu. Nhuộm Hematoxylin, Eosin giúp quan sát mẫu dễ dàng hơn.

2.3.8.2. Quy trình thí nghiệm

Bước 1: Rửa mẫu

- Mẫu được lấy từ dung di ̣ch Bouin được rửa nước qua đêm. Bước 2: Chuyển đệm

- Mẫu được ngâm lần lượt các dung dịch cồn 70, 80, 90, 96 trong 45 phút mỗi dung dịch. Sau đo tiếp tục ngâm trong cồn 100, xylen-cồn, xylen 1, xylen 2 trong 1 giờ mỗi dung dịch.

Bước 3: Tẩm paraffin

- Mẫu tiếp tục được ngâm trong xylen-parafin ở 37C qua đêm.

- Mẫu được chuyển sang ngâm trong parafin 1 trong 5 giờ, parafin 2trong 6 giờ ở 60C.

Bước 4: Đúc mẫu

- Các mẫu khác nhau được chia vào các giếng trong đĩa elisa 24 giếng chú ý đặt mẫu thẳng và chính giữa giếng. Để qua đêm để mẫu khô và đông.

Bước 5: Cắt mẫu và gắn lên lam kính

- Cắt lát dày 7-15µm bằng máy cắt mô học. - Thả lát cắt mẫu vào 1 bát nước ấm: 60-70C. - Lên lam.

 Bơi albumin lên lam kính (gắn mẫu dễ dàng hơn , giữ mẫu trong các bước rửa tiếp theo). Không bôi quá nhiều vì khi nhuô ̣m mẫu sẽ bắt màu đâ ̣m.

 Hơ lam kính trên ngo ̣n lửa đèn cờn cho khơ albumin, vớt lát cắt lên lam kính vào vi ̣ trí có albumin.

- Bảo quản trong tủ ấm 37C trong 1 ngày. Bước 6: Loại parafin

- Ngâm lam kính trong xylen 2, rồi xylen 1, mỗi lần 45 phút.

- Chuyển mẫu vào nước 1-2 phút, sau đó vớt ra, để ráo nước rồi nhuộm. Bước 7: Nhuộm

- Nhuộm Hematoxylin trước trong 15-20 phút.

- Rửa lại bằng nước, để ráo rồi nhuộm Eosin, 5-15 phút. Bước 8: Loại nước, làm trong tiêu bản

- Chuyển nhanh tiêu bản qua dung dịch cồn nồng độ tăng dần: 70°, 90°, 96°, 100° lần 1 và 100° lần 2, mỗi lần 1-2 phút.

- Chuyển tiêu bản qua cồn-xylen, xylen 1, xylen 2, mỗi lần 1-2 phút (riêng xylen 2 ngâm cho tới khi gắn laenzyme)

Bước 9: Gắn laenzyme

- Để bay hơi bớt xylen, lau bỏ phần thuốc nhuô ̣m thừa và mẫu hỏng - Gắn laenzyme bằng nhựa thông bôm Canada

- Bảo quả trong tủ ấm 37°C cho khô Bước 10:Soi kính và chụp ảnh

2.3.9. Cholesteol trong huyết thanh

Tiến hành theo phương pháp của Deeg R. và Zlegenhorn J. trên máy xét nghiệm hóa sinh máu bán tự động [40].

Nguyên tắc:

Quinoneimin có màu đỏ, độ hấp thụ ở 520nm tỷ lệ với nồng độ cholesterol toàn phần trong mẫu thử.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Quy trình tách chiết 5-ALA từ là ổi 3.1. Quy trình tách chiết 5-ALA từ là ổi

Hình3.1: Quy trình tách chiết 5-ALA từ lá ổi.

Sau quá trình tách chiết và tinh sạch ta thấy 5-ALA ra ở phân đoạn từ thứ 9-12 với độ tinh sạch khá cao 90% qua sự kiểm tra nhờ HPLC dưới đây.

3.2. Xác định hàm lƣợng 5-ALA trong lá ổi

Hình 3.2: Sắc ký đồ của dịch chiết tổng số.

Hình 3.3: Sắc ký đồ của dịch chiết sau khi tinh sạch.

Hình 3.4: Sắc ký đồ của 5-ALA chuẩn (sigma).

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min 0 1000 2000 3000 4000 mAU 352nm,4nm (1.00) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min -2.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 mAU 254nm,4nm (1.00) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min 0 25 50 75 mAU 254nm,4nm (1.00)

Hình 3.5: Bƣớc sóng hấp thụ của 5-ALA.

Qua sắc ký đồ (Hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4) ta thấy lượng chất tạp chất trong dịch chiết tổng số rất nhiều.Nhưng sau khi tách chiết xong thì lượng tạp chất đã giảm đáng kể. So sánh với chất chuẩn của sigma thì ta thấy nồng độ và độ tinh sạch của chất là tương đối cao. 5-ALA có bước sóng hấp thụ ở 237 và phát ra ở 269 và có thời gian lưu cột là từ phút thứ 6,5 đến 7,5.

Hình3.6: Đƣờng chuẩn của 5-ALA.

Chất chuẩn 5-ALA được chạy 5 lần chạy mẫu theo thể tích các lần 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt là 10µl, 20µl, 30µl, 40µl, 50µl. Ta lập được đường chuẩn như hình 3.6 với R2= 0.9894421 hệ số tương quan khá cao.

250 300 350 400 nm 0 1000 2000 mAU 6.25/ 1.00 23 7 26 9 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 9000000 10000000 11000000 12000000 Area 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Conc.(x10) 1 2 3 4 5 Y = aX + b a = 3.593484e-006 b = 4.762854 R2 = 0.9894421

Hình 3.7. Dịch chiết sau tinh sạch đƣợc so sánh trên đƣờng chuẩn 5-ALA.

Bảng 3.1: Diện tích các Pic ứng với các thể tích là 10, 20, 30, 40, 50µl và dịch chiết sau tinh sạch

Level Conc. SD Area1 Area2

1 10 2064948

2 20 3689345

3 30 6884368

4 40 153537.2 9599403 9816537

5 50 12877090

Sau khi tinh sạch và chạy sắc ký, số liệu đường tính tốn theo đường chuẩn 5-ALA cho thấyđộ tinh sạch của 5-ALA là 90%, nồng độ của 5-ALA sau khi tinh sạch là 0,436 mg/ml và trong lá ổi là 97mg/kg lá ổi.

3.3. Thử độc tính của 5-ALA trên chuột.

Để đánh giá sự an toàn của dịch chiết lá ổi, chuột được cho uống ở nồng độ 400mg/kg trọng lượng chuột. Kết quả về sự ổn định đường huyết của chuột được trình bày trong hình 3.7.

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 9000000 10000000 11000000 12000000 Area 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Conc.(x10) 1 2 3 4 5

Hình 3.8: Nồng độ glucose trong máu của chuộtkhi uống 400mg/kg dịch chiết dịch chiết

Kết quả (hình 3.8) cho thấy, sự thay đổi glucose trong máu của các nhóm chuột thí nghiệm sau thời gian 7 ngày uống dịch chiết lá ổi ở nồng độ khảo sát khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với nhóm khơng uống dịch chiết. Ngoài ra, qua 7 ngày uống dịch chiết lá ổi ở nồng độ 400mg/kg trọng lượng chuột, chuột có biểu hiện bình thường, khơng có các biểu hiện như sốc thuốc, co ro, di chuyển chậm chạp, lơng bị vón hay xù, rụng lơng nhiều, chuột bị gầy, tử vong do uống dịch chiết lá ổi. Từ tất cả các kết quả trình bày trên cho dịch chiết lá ổi khơng gây độc tính cấp trên chuột bình thường ở nồng độ 400mg/kg ở thời gian 7 ngày.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 4 7 Glu co se tr on g m áu ( m m ol/l)

Thời gian (ngày)

3.3.1. Đánh giá hàm lƣợng glucose trong máu.

Sau khi kiểm tra chắc chắn chuột bị tiểu đường ta bắt đầu cho uống thuốc Gliclazide và 5-ALA. Cứ 5 ngày ta kiểm tra nồng độ glucozo 1 lần. Ta được kết quả như sau.

Hình3.9: Hàm lƣợng glucose trong máu

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học

- Nhóm 2 : đối chứng dương được tiêm alloxan monohydrate - Nhóm 3 : được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg. - Nhóm 4: được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg - Nhóm 5: được điều trị với 5-ALA liều 150mg/kg - Nhóm 6: được điều trị với 5-ALA liều 200mg/kg

Ta thấy hàm lượng glucose thay đổi rõ rệt ở các nhóm được điều trị so với nhóm đối chứng dương. Vào ngày thứ 21 ta thấy hàm lượng glucosemột số nhóm đã về dưới ngưỡng an tồn là 7 mmol/l và đặc biệt ở nhóm 5 nồng

thường (nhóm 1). Chứng tỏ khả năng làm giảm lượng glucose trong máu của 5-ALA là khá tốt. Ngoài ra khả năng giảm glucose của 5-ALA ngang bằng với thuốc Gliclazide ngồi thị trường qua số liệu nhóm 3 và nhóm 5 lần lượt là 6,17 mmol/l và 5,40 mmol/l.

3.3.2. Đánh giá hàm lƣợng insulin trong máu.

Sau khi kiểm tra chắc chắn chuột bị tiểu đường ta bắt đầu cho uống thuốc Gliclazide và 5-ALA. Cứ 5 ngày ta kiểm tra nồng độ insulin 1 lần. Ta được kết quả như sau.

Hình 3.10: Hàm lƣợng insulin trong máu.

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học

Qua hình 3.10 ta thấy hàm lượng insulin trong máu của các nhóm điều trị có thay đổi rõ rệt theo chiều tích cực đặc biệt ở nhóm 5 vào ngày số 21 đã giảm xuống 9,3lU/ml so với nhóm đối chứng âm là 5,9lU/ml đã gần trở về bình thường. Cho thấy 5-ALA thật sự có hiệu quả trong việc điều trị bệnh tiểu đường vì nó khơng những tác động đến nồng độ glucose trong máu mà còn tác động đến hàm lượng insulin trong máu.Nhóm 3 thuốc Gliclazide cũng có khả năng làm giảm insulin nhưng qua kết quả ta thấy nó thấp hơn liều lượng tốt nhất của 5-ALA là 10,1lU/ml và 9,3lU/ml.

3.3.3. Đánh giá hàm lƣợng HbA1c trong máu.

Sau khi kiểm tra chắc chắn chuột bị tiểu đường ta bắt đầu cho uống thuốc Gliclazide và 5-ALA. Cứ 5 ngày ta kiểm tra nồng độ HbA1c 1 lần. Ta được kết quả như sau.

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học

Hàm lượng HbA1c được thể hiện qua hình 3.11 cho ta thấy ngồi khả năng tác động đến glucose và insulin trong máu thì 5-ALA cịn có khả năng tác động đến HbA1c khá tốt, thể hiện qua nhóm 5 và nhóm 6 với nồng độ là 41,40mmol/molvà 42,52mmol/mol.Cịn ở thuốc Gliclazide nhóm 3 thì khơng có khả năng làm giảm nồng độ HbA1c thể hiện qua số liệu ở ngày thứ 21 là 46,15mmol/mol và 48,51 mmol/molso với nhóm đối chứng dương thì sự thay đổi này là khơng đáng kể .Ta có thể nói rằng 5-ALA có khả năng điều trị tác động sâu hơn so với các thuốc ngồi thị trường vì hàm lượng HbA1c thường thay đổi rất chậm do nó phụ thuộc vào quá trình thay hồng cầu .

3.3.4. Tác động của 5-ALA đến tế bào thận và tụy trên chuột bị tiểu đƣờng. A E C D F B

- Hình 3.12A: nhóm đối chứng sinh học

- Hình3.12B: nhóm đối chứng dương được tiêm alloxan monohydrate - Hình 3.12C: nhóm được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg. - Hình 3.12D: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg - Hình 3.12E: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 150mg/kg - Hình 3.12F: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 200mg/kg

Qua hình ảnh tiêu bản thận các nhóm chuột (hình 3.12) ta thấy ở nhóm đối chứng sinh học (hình 3.12A) các tề bào thận ở trạng thái bình thường nhưng ở nhóm đối chứng dương (hình 3.12B) thì ta thấy sự phá hủy khá nghiêm trọng của alloxan monohydrate với tế bào thận. Các tế bào bị vỡ sắp xếp không theo trật tự đặc biệt xuất hiện các vết nứt kéo dài. Hình 3.12E và 3.12F cho thấy cả gliclazide và 5-ALA đều có khả năng chữa trị và giúp tái tạo bảo vệ tế bào thận. Ở nhóm được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg và nhóm được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg cũng thấy khả năng điều trị của 5-ALA nhưng không rõ rệt thể hiện qua hình 3.12C và 3.12D.

- Hình 3.13A: nhóm đối chứng sinh học

- Hình3.13B: nhóm đối chứng dương được tiêm alloxan monohydrate - Hình 3.13C: nhóm được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg. - Hình 3.13D: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg - Hình 3.13E: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 150mg/kg - Hình 3.13F: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 200mg/kg

Hình3.13 cho ta thấy hình ảnh tiêu bản tế bào tụy. Hình 3.13B ta cũng thấy sự phá hoại tế bào tụy của alloxan monohydratevà ta đều có thể thấy ở đây đã có sự chữa trị.

Tóm lại, 5-ALA có khả năng chữa trị bệnh tiểu đường rất tốt không chỉ làm giảm nồng độ glucose 5-ALA cịn có khả năng điều trị sâu giảm được cả nồng độ HbA1c trong máu mà nhiều thuốc bán ngoài thịtrường hiện tại chưa làm được. Điều này còn tiếp tục được khẳng định lại một lần nữa qua các tiêu bản thận và tụy.

3.4. Tác động của 5-ALA tới các tế bào gan trên chuột bị tiểu đƣờng 3.4.1. Hoạt động của GOT trong bệnh tiểu đƣờng.

Bằng kit xác định GOT đã chứng minh được khả năng bảo vệ gan của 5-ALA qua biểu đồ sau:

Hình 3.14: Chỉ số GOT trong bệnh tiểu đƣờng.

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học.

- Nhóm 2 : đối chứng dương được tiêm alloxan monohydrate. - Nhóm 3 : được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg. - Nhóm 4: được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg. - Nhóm 5: được điều trị với 5-ALA liều 150mg/kg. - Nhóm 6: được điều trị với 5-ALA liều 200mg/kg.

Qua biểu đồ và bảng số liệu ta thấy hoạt động GOT nhóm đối chứng dương tăng gấp 6 lần so với đối chứng âm điều đó chứng tỏ tế bào mơ gan đã bị phá hoại mạnh. Nhưng hoạt động GOT chưa mang tính đặc hiệu cho gan. Ở đây ta cũng thấy hoạt động bảo vệ gan của 5-ALA cũng được thể hiện rõ rệt. Hoạt động của GOT đã gần như trở lại bình thường và nồng độ 5-ALA ở 150 mg/kg đã hoạt động rất tốt . Ở nồng độ 200 mg/kg hoạt động của GOT có giảm nhưng khơng đáng kể so với ở nồng độ 150 mg/kg.

3.4.2. Hoạt động của GPT trong bệnh tiểu đƣờng

Bằng kit xác định GPT đã chứng minh được khả năng bảo vệ gan của 5-ALA qua biểu đồ sau:

Hình3.15: Chỉ số GPT trong bệnh tiểu đƣờng

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học.

Qua bảng số liệu và biểu đồ ta thấy hoạt động GPT nhóm đối chứng dương tăng gấp 11 lần nhóm đối chứng âm điều đó càng chứng tỏ tế bào mơ

Xác định chỉ số GOT, GPT, ALP và Bilirubin

Tiêu bản tế bào tụycủa các nhóm chuột

Tiêu bản tế bào gan củacác nhóm chuột