Sắc ký đồ của dịch chiết sau khi tinh sạch- 123docz.net

Hình 3.4: Sắc ký đồ của 5-ALA chuẩn (sigma).

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min 0 1000 2000 3000 4000 mAU 352nm,4nm (1.00) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min -2.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 mAU 254nm,4nm (1.00) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min 0 25 50 75 mAU 254nm,4nm (1.00)

Hình 3.5: Bƣớc sóng hấp thụ của 5-ALA.

Qua sắc ký đồ (Hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4) ta thấy lượng chất tạp chất trong dịch chiết tổng số rất nhiều.Nhưng sau khi tách chiết xong thì lượng tạp chất đã giảm đáng kể. So sánh với chất chuẩn của sigma thì ta thấy nồng độ và độ tinh sạch của chất là tương đối cao. 5-ALA có bước sóng hấp thụ ở 237 và phát ra ở 269 và có thời gian lưu cột là từ phút thứ 6,5 đến 7,5.

Hình3.6: Đƣờng chuẩn của 5-ALA.

Chất chuẩn 5-ALA được chạy 5 lần chạy mẫu theo thể tích các lần 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt là 10µl, 20µl, 30µl, 40µl, 50µl. Ta lập được đường chuẩn như hình 3.6 với R2= 0.9894421 hệ số tương quan khá cao.

250 300 350 400 nm 0 1000 2000 mAU 6.25/ 1.00 23 7 26 9 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 9000000 10000000 11000000 12000000 Area 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Conc.(x10) 1 2 3 4 5 Y = aX + b a = 3.593484e-006 b = 4.762854 R2 = 0.9894421

Hình 3.7. Dịch chiết sau tinh sạch đƣợc so sánh trên đƣờng chuẩn 5-ALA.

Bảng 3.1: Diện tích các Pic ứng với các thể tích là 10, 20, 30, 40, 50µl và dịch chiết sau tinh sạch

Level Conc. SD Area1 Area2

1 10 2064948

2 20 3689345

3 30 6884368

4 40 153537.2 9599403 9816537

5 50 12877090

Sau khi tinh sạch và chạy sắc ký, số liệu đường tính tốn theo đường chuẩn 5-ALA cho thấyđộ tinh sạch của 5-ALA là 90%, nồng độ của 5-ALA sau khi tinh sạch là 0,436 mg/ml và trong lá ổi là 97mg/kg lá ổi.

3.3. Thử độc tính của 5-ALA trên chuột.

Để đánh giá sự an toàn của dịch chiết lá ổi, chuột được cho uống ở nồng độ 400mg/kg trọng lượng chuột. Kết quả về sự ổn định đường huyết của chuột được trình bày trong hình 3.7.

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 9000000 10000000 11000000 12000000 Area 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Conc.(x10) 1 2 3 4 5

Hình 3.8: Nồng độ glucose trong máu của chuộtkhi uống 400mg/kg dịch chiết dịch chiết

Kết quả (hình 3.8) cho thấy, sự thay đổi glucose trong máu của các nhóm chuột thí nghiệm sau thời gian 7 ngày uống dịch chiết lá ổi ở nồng độ khảo sát khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với nhóm khơng uống dịch chiết. Ngồi ra, qua 7 ngày uống dịch chiết lá ổi ở nồng độ 400mg/kg trọng lượng chuột, chuột có biểu hiện bình thường, khơng có các biểu hiện như sốc thuốc, co ro, di chuyển chậm chạp, lơng bị vón hay xù, rụng lơng nhiều, chuột bị gầy, tử vong do uống dịch chiết lá ổi. Từ tất cả các kết quả trình bày trên cho dịch chiết lá ổi khơng gây độc tính cấp trên chuột bình thường ở nồng độ 400mg/kg ở thời gian 7 ngày.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 4 7 Glu co se tr on g m áu ( m m ol/l)

Thời gian (ngày)

3.3.1. Đánh giá hàm lƣợng glucose trong máu.

Sau khi kiểm tra chắc chắn chuột bị tiểu đường ta bắt đầu cho uống thuốc Gliclazide và 5-ALA. Cứ 5 ngày ta kiểm tra nồng độ glucozo 1 lần. Ta được kết quả như sau.

Hình3.9: Hàm lƣợng glucose trong máu

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học

- Nhóm 2 : đối chứng dương được tiêm alloxan monohydrate - Nhóm 3 : được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg. - Nhóm 4: được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg - Nhóm 5: được điều trị với 5-ALA liều 150mg/kg - Nhóm 6: được điều trị với 5-ALA liều 200mg/kg

Ta thấy hàm lượng glucose thay đổi rõ rệt ở các nhóm được điều trị so với nhóm đối chứng dương. Vào ngày thứ 21 ta thấy hàm lượng glucosemột số nhóm đã về dưới ngưỡng an tồn là 7 mmol/l và đặc biệt ở nhóm 5 nồng

thường (nhóm 1). Chứng tỏ khả năng làm giảm lượng glucose trong máu của 5-ALA là khá tốt. Ngoài ra khả năng giảm glucose của 5-ALA ngang bằng với thuốc Gliclazide ngoài thị trường qua số liệu nhóm 3 và nhóm 5 lần lượt là 6,17 mmol/l và 5,40 mmol/l.

3.3.2. Đánh giá hàm lƣợng insulin trong máu.

Sau khi kiểm tra chắc chắn chuột bị tiểu đường ta bắt đầu cho uống thuốc Gliclazide và 5-ALA. Cứ 5 ngày ta kiểm tra nồng độ insulin 1 lần. Ta được kết quả như sau.

Hình 3.10: Hàm lƣợng insulin trong máu.

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học

Qua hình 3.10 ta thấy hàm lượng insulin trong máu của các nhóm điều trị có thay đổi rõ rệt theo chiều tích cực đặc biệt ở nhóm 5 vào ngày số 21 đã giảm xuống 9,3lU/ml so với nhóm đối chứng âm là 5,9lU/ml đã gần trở về bình thường. Cho thấy 5-ALA thật sự có hiệu quả trong việc điều trị bệnh tiểu đường vì nó khơng những tác động đến nồng độ glucose trong máu mà còn tác động đến hàm lượng insulin trong máu.Nhóm 3 thuốc Gliclazide cũng có khả năng làm giảm insulin nhưng qua kết quả ta thấy nó thấp hơn liều lượng tốt nhất của 5-ALA là 10,1lU/ml và 9,3lU/ml.

3.3.3. Đánh giá hàm lƣợng HbA1c trong máu.

Sau khi kiểm tra chắc chắn chuột bị tiểu đường ta bắt đầu cho uống thuốc Gliclazide và 5-ALA. Cứ 5 ngày ta kiểm tra nồng độ HbA1c 1 lần. Ta được kết quả như sau.

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học

Hàm lượng HbA1c được thể hiện qua hình 3.11 cho ta thấy ngoài khả năng tác động đến glucose và insulin trong máu thì 5-ALA cịn có khả năng tác động đến HbA1c khá tốt, thể hiện qua nhóm 5 và nhóm 6 với nồng độ là 41,40mmol/molvà 42,52mmol/mol.Cịn ở thuốc Gliclazide nhóm 3 thì khơng có khả năng làm giảm nồng độ HbA1c thể hiện qua số liệu ở ngày thứ 21 là 46,15mmol/mol và 48,51 mmol/molso với nhóm đối chứng dương thì sự thay đổi này là khơng đáng kể .Ta có thể nói rằng 5-ALA có khả năng điều trị tác động sâu hơn so với các thuốc ngồi thị trường vì hàm lượng HbA1c thường thay đổi rất chậm do nó phụ thuộc vào q trình thay hồng cầu .

3.3.4. Tác động của 5-ALA đến tế bào thận và tụy trên chuột bị tiểu đƣờng. A E C D F B

- Hình 3.12A: nhóm đối chứng sinh học

- Hình3.12B: nhóm đối chứng dương được tiêm alloxan monohydrate - Hình 3.12C: nhóm được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg. - Hình 3.12D: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg - Hình 3.12E: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 150mg/kg - Hình 3.12F: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 200mg/kg

Qua hình ảnh tiêu bản thận các nhóm chuột (hình 3.12) ta thấy ở nhóm đối chứng sinh học (hình 3.12A) các tề bào thận ở trạng thái bình thường nhưng ở nhóm đối chứng dương (hình 3.12B) thì ta thấy sự phá hủy khá nghiêm trọng của alloxan monohydrate với tế bào thận. Các tế bào bị vỡ sắp xếp không theo trật tự đặc biệt xuất hiện các vết nứt kéo dài. Hình 3.12E và 3.12F cho thấy cả gliclazide và 5-ALA đều có khả năng chữa trị và giúp tái tạo bảo vệ tế bào thận. Ở nhóm được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg và nhóm được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg cũng thấy khả năng điều trị của 5-ALA nhưng khơng rõ rệt thể hiện qua hình 3.12C và 3.12D.

- Hình 3.13A: nhóm đối chứng sinh học

- Hình3.13B: nhóm đối chứng dương được tiêm alloxan monohydrate - Hình 3.13C: nhóm được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg. - Hình 3.13D: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg - Hình 3.13E: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 150mg/kg - Hình 3.13F: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 200mg/kg

Hình3.13 cho ta thấy hình ảnh tiêu bản tế bào tụy. Hình 3.13B ta cũng thấy sự phá hoại tế bào tụy của alloxan monohydratevà ta đều có thể thấy ở đây đã có sự chữa trị.

Tóm lại, 5-ALA có khả năng chữa trị bệnh tiểu đường rất tốt không chỉ làm giảm nồng độ glucose 5-ALA cịn có khả năng điều trị sâu giảm được cả nồng độ HbA1c trong máu mà nhiều thuốc bán ngoài thịtrường hiện tại chưa làm được. Điều này còn tiếp tục được khẳng định lại một lần nữa qua các tiêu bản thận và tụy.

3.4. Tác động của 5-ALA tới các tế bào gan trên chuột bị tiểu đƣờng 3.4.1. Hoạt động của GOT trong bệnh tiểu đƣờng.

Bằng kit xác định GOT đã chứng minh được khả năng bảo vệ gan của 5-ALA qua biểu đồ sau:

Hình 3.14: Chỉ số GOT trong bệnh tiểu đƣờng.

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học.

- Nhóm 2 : đối chứng dương được tiêm alloxan monohydrate. - Nhóm 3 : được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg. - Nhóm 4: được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg. - Nhóm 5: được điều trị với 5-ALA liều 150mg/kg. - Nhóm 6: được điều trị với 5-ALA liều 200mg/kg.

Qua biểu đồ và bảng số liệu ta thấy hoạt động GOT nhóm đối chứng dương tăng gấp 6 lần so với đối chứng âm điều đó chứng tỏ tế bào mô gan đã bị phá hoại mạnh. Nhưng hoạt động GOT chưa mang tính đặc hiệu cho gan. Ở đây ta cũng thấy hoạt động bảo vệ gan của 5-ALA cũng được thể hiện rõ rệt. Hoạt động của GOT đã gần như trở lại bình thường và nồng độ 5-ALA ở 150 mg/kg đã hoạt động rất tốt . Ở nồng độ 200 mg/kg hoạt động của GOT có giảm nhưng khơng đáng kể so với ở nồng độ 150 mg/kg.

3.4.2. Hoạt động của GPT trong bệnh tiểu đƣờng

Bằng kit xác định GPT đã chứng minh được khả năng bảo vệ gan của 5-ALA qua biểu đồ sau:

Hình3.15: Chỉ số GPT trong bệnh tiểu đƣờng

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học.

Qua bảng số liệu và biểu đồ ta thấy hoạt động GPT nhóm đối chứng dương tăng gấp 11 lần nhóm đối chứng âm điều đó càng chứng tỏ tế bào mơ gan đã bị phá hoại mạnh. Vì hoạt động của GPT đặc trưng ở gan. Ở đây ta cũng thấy hoạt động bảo vệ gan của 5-ALA cũng được thể hiện rõ rệt. Hoạt động của GPT đã gần như trở lại bình thường và nồng độ 5-ALA ở150 mg/kg

đã hoạt động rất tốt. Ở nồng độ 200 mg/kg hoạt động của GPT có giảm nhưng khơng đáng kể so với ở nồng độ 150 mg/kg.

3.4.3. Hoạt động của ALP trong bệnh tiểu đƣờng.

Bằng kit xác định ALP đã chứng minh được khả năng bảo vệ gan của 5-ALA qua biểu đồ sau:

Hình3.16: Chỉ số ALP trong bệnh tiểu đƣờng.

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học.

Các tế bào gan bị hư hỏng phóng thíchsố lượng ALP vào máutăng. Nó được thể hiện rất rõ trong biểu đồ. Nhóm 2 nồng độ ALP cao hơn nhóm 1 rất nhiều gần 7 lần chứng tỏ alloxan monohydrate có khả năng gây độc cho gan.

thái bình thường với nồng độ ALP lần lượt là 57,43 UI/L và 52,67 UI/L so với nhóm đối chứng (nhóm 1) 31,15 UI/L.

3.4.4. Hoạt động của Bilirubin trong bệnh tiểu đƣờng.

Bằng kit xác định Bilirubin đã chứng minh được khả năng bảo vệ gan của 5-ALA qua biểu đồ sau:

Hình 3.17:Chỉ số Bilirubin trong bệnh tiểu đƣờng

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học.

Vì bilirubin trực tiếp sẽ được lưu giữ trong tế bào gan chuyển qua mật và được thải ra ngoài nhưng do tế bào gan bị phá hoại lên phần lớn bilirubin lại bị chuyển sang dạng gián tiếp rồi vào máu. Dẫn đến nồng độ bilirubin gián tiếp trong máu tăng cao. Cũng giống như 2 chỉ số trước ta thấy được sự tác động rõ rệt của 5-ALA. Nồng độ 5-ALA ở 150 mg/kg được cho là hiệu quả trong việc bảo vệ gan của 5-ALA.

3.4.5. Tác động trên tế bào gan của 5-ALA.

E F

C D

Hình 3.18: Tiêu bản tế bào gan của các nhóm chuột.

- Hình 3.17A: nhóm đối chứng sinh học

- Hình 3.17B: nhóm đối chứng dương được tiêm alloxan monohydrate - Hình 3.17C: nhóm được điều trịvới Gliclazide liều 19,2mg/kg.

- Hình 3.17D: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 100mg/kg - Hình 3.17E: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 150mg/kg - Hình 3.17F: nhóm được điều trị với 5-ALA liều 200mg/kg

Ta thấy hình 3.17B tế bào gan bịphá hủy khá nghiêm trọng bởi alloxan monohydrate.Mặc dù là chất độc gây bệnh tiểu đường gần ảnh hưởng đến thận rất nhiều nhưng chúng cũng ảnh hưởng rất lớn đến tê bào gan vì mọi chất độc vào cơ thể sẽ đều ảnh hưởng tới gan. Hình 3.17E+F cho thấy 5-ALA có khả năng điều trị khá tốt cịn gliclazide và 5-ALA ở nồng độ 100mg/kg thì gần như khơng có khả năng chữa trị.

- Nhóm 1 : đối chứng sinh học

Sau 21 ngày ni có sự thay đổi rõ rệt về nồng độ cholesterol giữa các nhóm chuột. Ở nhóm 1(đối chứng âm) cho thấy hàm lượng cholesterol là 3,44 mm/l trong khi nhóm đối 2 (đối chứng dương) có hàm lượng cholesterol trong máu là 6,1 mm/l, gấp 1,77 lần so với nhóm 1. Các nhóm được điều trị bằng 5- ALA cho thấy khả năng làm giảm nồng độ cholesterol một cách đáng kể, đặc biệt là 3 nhóm 4 (100 mg/kg) và nhóm 5 (150 mg/kg) và nhóm 6(200mg/kg) với các nồng độ cholesterol lần lượt là 3,66 mm/l và 3,68 mm/l và 3,56 mm/l đưa mức cholesterol trở về gần như mức bình thường của cơ thể. Nhóm 3 được điều trị với Gliclazide liều 19,2mg/kg cho thấy sự giảm nhẹ nồng độ cholesterol ở mức 5,68 mm/l. Cho thấy 5-ALA có khả năng giúp phân giải chất béo cịn Gliclazide thì khơng. 5-ALA có hoạt tính hóa mạnh giúp tăng cường khả năng chuyển hóa năng lượng.

KẾT LUẬN

 Bước đầu tách chiết thành công 5-ALA từ lá ổi với độ tinh sạch 90% và hàm lượng 0,436 mg/ml.

 Tác động của 5-ALA trên chuột bị tiểu đường đã có hiệu lực ở liều

Sắc ký đồ của dịch chiết sau khi tinh sạch

Tiêu bản tế bào tụycủa các nhóm chuột

Tiêu bản tế bào gan củacác nhóm chuột