CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.4. Ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu
hiệu JAK/STAT
3.4.1. ATRA ức chế biểu hiện của các gen STAT1 và STAT3
Để nghiên cứu tác động của ATRA lên con đường tín hiệu JAK/STAT, chúng tơi đi phân tích ảnh hưởng của ATRA lên sự phiên mã của 6 gen chính trong con đường tín hiệu này bao gồm: GAB1, SRC, GAB2, PPP2CA, STAT1 và STAT3.
Hình 3.5A. Mức độ biểu hiện các gen STAT3, STAT1
STAT1 và STAT3 thuộc họ protein STAT, là yếu tố trung tâm quyết định sự thúc đẩy hay ức chế các tế bào ung thư thông qua các đáp ứng miễn dịch. Kết quả phân tích biểu hiện mRNA ở hình 3.5A cho thấy, ATRA làm giảm sự biểu hiện mRNA của STAT1 (15%) và STAT3 (40%).
STAT3 làm tăng cường sự phân chia, sống sót và xâm lấn của các tế bào thuộc khối u bằng cách ức chế hệ thống miễn dịch chống lại khối u, đồng thời STAT3 được hoạt hóa liên tục gián tiếp gây ra hiện tượng viêm nhiễm làm thúc đẩy sự phát triển của khối u [5]. Shu Zhang và cộng sự đã phát hiện thấy có sự biểu hiện quá mức của STAT3 khi niêm mạc dạ dày đạt đến giai đoạn khối u [96]. Trong nghiên cứu này, từ kết quả phân tích biểu hiện gen, chúng tôi đã xác định được ATRA làm giảm biểu hiện của STAT3 ở mức độ phiên mã, mức độ giảm biểu hiện xác định được khoảng 40% so với đối chứng.
Gen STAT1 mã hóa cho protein STAT1 thuộc họ protein STAT. STAT1 có vai trị chính trong nhiều điều hịa biểu hiện gen ảnh hưởng đến sự sống sót tế bào, khả năng sống sót hoặc phản ứng của các mần bệnh [28]. STAT1 có tác động ức chế hoặc kích thích khối u tùy thuộc vào từng loại ung thư [51], [64], [77]. Kết quả nghiên cứu này cho thấy, ATRA tác động làm giảm hoạt động của STAT1 ở mức độ phiên mã. Mức độ giảm thiểu số lượng mRNA được xác định vào khoảng 15% so với đối chứng khơng xử lí với ATRA. Như vậy, từ kết quả nghiên cứu có thể xác định, ở các tế bào gốc ung thư dạ dày MKN45, STAT1 hoạt động như một chất kích thích khối u.
Như vậy, sự suy giảm hoạt động của STAT3 có thể là một trong những cơ chế quan trọng để ATRA làm giảm sự tăng trưởng của các tế bào ung thư MKN45 thông qua con đường tín hiệu JAK/STAT. Hơn nữa, sự suy thiểu hoạt động của STAT3 có thể tác động tích cực đến q trình viêm do nhiễm
H. pylori.
3.4.2. Ảnh hưởng của ATRA đến sự điều hòa biểu hiện của các gen GAB1, GAB2, SRC và PPP2CA GAB2, SRC và PPP2CA
Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn phân tích một nhóm các protein có vai trị quan trọng trong trung gian truyền tải tín hiệu. Kết quả phân
tích ở hình 3.5B cho thấy biểu hiện của các gen GAB1, GAB2 và SRC ở mức độ phiên mã suy giảm khi chịu tác động của ATRA, trong khi đó, biểu hiện gen PPP2CA khơng có sự thay đổi đáng kể so với đối chứng.
GAB1 là một docking protein thuộc họ Gab/DOS tham gia vào quá trình điều hịa các con đường tín hiệu bằng cách chuyển tiếp hoặc phản hồi tín hiệu đối với các sự kiện phosphorin hóa cũng như sự tương tác protein– protein. GAB1 liên quan đến các tín hiệu tăng sinh tế bào, di chuyển và hình thành biểu mô [89]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy dưới tác động của ATRA, các tế bào gốc ung thư dạ dày KMN45 có biểu hiện gen GAB1 suy giảm ở mức độ phiên mã so với các mẫu khơng xử lí với ATRA. Số lượng mRNA GAB1 của các tế bào MKN45 xử lí với ATRA đã suy giảm khoảng 30% so với các mẫu khơng xử lí với ATRA. Như vậy, sự suy giảm biểu hiện GAB1 sẽ dẫn tới sự thay đổi mức độ dẫn truyền các tín hiệu phát triển của tế bào.
Hình 3.5B. Mức độ biểu hiện các gen GAB1, SRC, GAB2, PPP2CA
(so sánh với mẫu đối chứng (DC), (n = 3, *p < 0,05)
SRC (sarcoma) là một proto-oncogene điều hịa tăng sinh, biệt hóa, vận động sống sót và tạo mạch [83]. Hoạt động của SRC tăng lên cùng với sự tiến triển của nhiều bệnh ung thư và sự kích hoạt SRC được xem như một dấu
hiệu sinh học cho sự phát triển của ung thư [42], [47]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy dưới sự tác động của ATRA, hoạt động của SRC ở mức độ phiên mã bị ức chế. Cụ thể, số lượng mRNA gen SRC của tế bào gốc ung thư dạ dày KMN45 xử lí với ATRA chỉ bằng khoảng 50% so với mẫu KMN45 không xử lí với ATRA. Matsumura T và cộng sự đã nhận thấy có sự lên kết biểu hiện của SRC và GAB2 trong điều kiện nuôi cấu 3D [60]. Trong nghiên cứu này, chúng tơi cũng nhận thấy có sự liên kết biểu hiện của SRC và GAB2, dưới tác động của ATRA, sự biểu hiện gen GAB2 và SRC giảm khoảng 50% ở mức độ phiên mã.
PP2A là một protein quan trọng trong nhiều chức năng sống của tế bào. PP2A điều chỉnh các quá trình sinh học khác nhau như chu trình tế bào, sao chép DNA, sao chép và dịch mã, truyền tín hiệu, tăng sinh tế bào và apoptosis. PP2A đã được chứng minh là đóng một vai trò trong chuyển đổi tế bào và ung thư [76]. PPP2CA mã hóa cho tiểu phần của enzyme phosphatase serine PP2A và được coi là một chất ức chế khối u tiềm năng [46]. Bhardwaj A và cộng sự nghiên cứu trên mơ hình chuột đã chứng minh, phục hồi biểu hiện của PPP2CA ức chế sự phát triển và di căn của khối u tuyến tiền liệt ở chuột thí nghiệm [8]. Trong nghiên cứu này dưới tác động của ATRA, chúng tơi khơng nhận thấy có sự thay đổi trong biểu hiện gen của PPP2CA ở mức độ phiên mã.
Từ kết quả nghiên cứu có thể thấy được, ở con đường tín hiệu JAK/STAT, ATRA có tác động ức chế biểu hiện của các gen STAT1, STAT3, GAB1, GAB2 và SRC, trong khi đó, biểu hiện gen PPP2CA khơng có sự thay đổi khi xử lí với ATRA.
3.5. Ảnh hưởng ATRA lên sự biểu hiện của các gen của quá trình apoptosis
Apoptosis là một cơ chế giúp cho các mơ phát triển bình thường, khơng phát sinh thành ung thư. Đối với mơ ung thư, tế bào có cơ chế kháng lại q trình apotosis và giúp cho nó tăng sinh khơng kiểm sốt. Sự tăng sinh không
kiểm soát của các tế bào ung thư cũng liên quan tới sự hoạt động mạnh của các con đường tín hiệu ung thư trong có có con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT. Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng ức chế của ATRA đối với các con đường tín hiệu ung thư EGF và JAK/STAT đã được chỉ ra. Từ đó, đưa ra giả thuyết rằng ATRA ức chế sự biểu hiện của con đường tín hiệu có thể dẫn tới thúc đẩy apoptosis. Để kiểm tra giả thuyết này, sự biểu hiện của các gen chủ chốt của apoptosis đã được phân tích.
3.5.1. ATRA tác động lên sự biểu hiện của các gen ức chế apoptosis
Để nghiên cứu tác động của ATRA lên q trình apoptosis, chúng tơi tiến hành phân tích biểu hiện của 8 gen thuộc 2 nhóm gen của q trình apoptosis gồm: nhóm gen gây ức chế apoptosis: AKT1, NUP62, BCL2, MAPK1 và nhóm gen thúc đẩy apoptosis: CASP9, FOXO3, IL2, p53.
Kết quả phân tích nhóm gen ức chế apoptosis ở hình 3.6A cho thấy: ATRA làm giảm rõ rệt biểu hiện mRNA của tất cả các gen ức chế apoptosis nghiên cứu khi so với mẫu đối chứng.
Hình 3.6A. Mức độ biểu hiện các gen ức chế apoptosis
AKT1 một protein có vai trị quan trọng trong con đường tín hiệu PI3K/AKT. AKT1 thúc đẩy sự tăng trưởng của tế bào và ức chế apoptosis. Hơn nữa, hoạt động chức năng của AKT1 chịu ảnh hưởng trực tiếp từ các thụ thể hạt nhân trong đó có RAR, mặc dù các cơ chế tác động chưa được làm rõ [59]. Kết quả phân tích biểu hiện gen cho thấy, AKT1 giảm biểu hiện ở mức độ phiên mã sau khi xử lí các tế bào MKN45 với ATRA. Mức độ biểu hiện của AKT1 trong các tế bào MKN45 xử lí với ATRA đã suy giảm khoảng 50% so với đối chứng.
Họ protein BCL2 điều hịa q trình apoptosis theo con đường nội sinh phụ thuộc ty thể, được kích hoạt để đáp ứng các tác nhân kích thích gây stress tế bào như thiếu các yếu tố tăng trưởng, các yếu tố cytokine, hư hỏng DNA do tia xạ cũng như góp phần gây apoptosis gây ra các yếu tố hoại tử khối u như Fas, TNF hoặc TRAIL. BCL2 ức chế apoptosis bằng cách can thiệp ức chế q trình kích hoạt BAX và BAK (2 protein có chức năng quan trọng trong sự điều chỉnh màng ty thể gây apoptosis). Các chức năng của BCL2 trong quá trình apoptosis bị ức chế bởi p53 [36]. Kinoshita Y và cộng sự đã chứng minh rằng ATRA làm giảm mạnh các marker kháng apoptosis BCL2 [50]. Trong nghiên cứu này, chúng tơi nhận thấy các tế bào MKN45 có sự suy giảm biểu hiện của gen BCL2 sau khi xử lí với ATRA.
Mitogen-activated protein kinase1 (MAPK1) thuộc họ MAP kinase. MAP tham gia vào một loạt các q trình như tăng sinh, biệt hóa, apoptosis của tế bào. MAPK1 đóng vai trị quan trọng trong sự tiến triển của khối u và các quá trình tế bào khối u khác nhau, việc bất hoạt MAPK làm tế bào bước vào quá trình apoptosis [13]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra rằng, dưới sự tác động của ATRA, các tế bào MKN45 có sự giảm thiểu ở mức độ biểu hiện của gen MAPK1. Sự giảm thiểu MAPK1 có thể là một trong những nguyên nhân dẫn đến việc các tế bào MKN45 bước vào quá trình apoptosis như đã quan sát được.
3.5.2. ATRA ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen thúc đẩy apoptosis
Trong nghiên cứu này, 4 gen đã được chứng minh là có chức năng thúc đẩy q trình apoptosis được phân tích bao gồm: CASP9, FOX3, IL2 và p53. Kết quả chỉ ra ở hình 3.6B cho thấy: ATRA làm tăng biểu hiện của tất cả các gen thúc đẩy apoptosis được chọn để nghiên cứu ở mức độ phiên mã khi so với mẫu đối chứng.
FOXO3, caspase-9 (được mã hóa bởi gen CASP9) và p53 (hay tp53) là
các protein tham gia hoạt hóa apoptosis thông qua con đường nội sinh (phụ thuộc ti thể). Caspase-9 (CASP9) được mã hóa bởi gen CASP9, là caspase khởi tạo quá trình apoptosis nội sinh [63]. Yoo và cộng sự (2007) đã chỉ ra rằng sự biểu hiện CASP9 thường bị ức chế trong tế bào ung thư dạ dày [93]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy ở các tế bào MKN45, CASP9 tăng cường biểu hiện ở mức độ phiên mã khi xử lí với ATRA. Hơn nữa, Mueller và cộng sự trong nghiên cứu trước đó đã kết luận: sự suy giảm hoạt động của CASP9 làm tăng cường ngưỡng apoptosis gây ra bởi cisplatin [67]. Điều này gợi ý rằng có thể sử dụng ATRA như một loại thuốc hỗ trợ khi điều trị ung thư bằng hóa trị.
Hình 3.6B. Mức độ biểu hiện các gen thúc đẩy apoptosis
(so sánh với đối chứng (DC), (n = 3, *p < 0,05)
Gen FOXO3 mã hóa cho protein FOXO3, thuộc họ protein Forkhead box (FOX). Sự kích hoạt FOXO3 dẫn đến apoptosis, ngừng chu kỳ tế bào, ngược lại, sự bất hoạt FOXO3 tăng cường sự sống tế bào và tăng sinh tế bào
[18]. Sự suy giảm hoạt động của FOXO3 đã được ghi nhận ở nhiều loại tế bào ung thư khác nhau [25]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định được hoạt động của FOXO3 đã được tăng cường ở mức độ phiên mã khi các tế bào gốc ung thư MKN45 được xử lí với ATRA. Ở các tế bào ung thư bạch cầu (APL), Sakoe Y và cộng sự (2010) cũng nhận thấy kết quả tương tự, FOXO3A tăng cường biểu hiện khi điều trị bằng ATRA [75]. Nghiên cứu của Sakoe cũng chỉ ra rằng FOXO3A là một phân tử quan trọng gây ra apoptosis khi điều trị bằng ATRA ở APL.
Tp53 hay p53 là một protein liên kết DNA làm dừng chu kỳ tế bào do căng thẳng gen [35], là gen thúc đẩy apoptosis có ý nghĩa quan trọng trong ung thư. Cơ bản p53 cản trở sự tăng sinh của các tế bào có DNA bị hỏng [71]. 50% số bệnh ung thư ở người đã được phát hiện có đột biến gen làm tổn hại trực tiếp đến chức năng của p53, trong phần lớn các khối u cịn lại có một tỷ lệ lớn các đột biến hoặc thay đổi biểu hiện thay đổi của các gen khác ảnh hưởng đến chức năng của protein p53 [84]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng ATRA tăng cường hoạt động của p53 ở các tế bào của ung thư tụy, ung thư máu và ung thư hắc sắc tố [57], [94], [98]. Trong nghiên cứu này, kết quả phân tích biểu hiện p53 ở mức độ phiên mã cho thấy, ATRA làm tăng cường hoạt động của gen p53 ở các tế bào ung thư MKN45.
Interleukin 2 (IL2), là một interleukin, đóng vai trị quan trọng trong tăng cường sự biểu hiện của các phân tử tiền apoptosis trong tế bào T [58]. Như vậy, IL2 là một chất thúc đẩy apoptosis tiềm năng. Fan và cộng sự (2017) đã chỉ ra ATRA làm tăng biểu hiện của IL2 ở các tế bào ung thư phổi [29]. Trong kết quả nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy các tế bào MKN45 được xử lí với ATRA có sự gia tăng biểu hiện gen IL2, biểu hiện của IL2 tăng gấp khoảng 3 lần so với các tế bào đối chứng khơng xử lí với ATRA.
Như vậy, ATRA đã tác động đến quá trình apoptosis ở tế bào gốc ung thư dạ dày MKN45 thông qua tác động suy giảm biểu hiện các gen ức chế apoptosis: AKT1, NUP62, BCL2, MAPK1 và tăng cường hoạt động của các gen thúc đẩy apoptosis: CASP9, FOXO3, IL2, p53.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1. Đã nuôi cấy thành công các tumorsphere 3D của các tế bào ung thư
MKN45 để phục vụ cho quá trình thử tác động của ATRA.
2. Đã chỉ ra rằng ATRA ức chế sự hình thành và tăng trưởng của các
tumorsphere.
3. ATRA đã làm giảm sự hoạt động của con đường tín hiệu EGF bằng
cách điều hòa giảm sự biểu hiện của các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5 và EGFR, nhưng không ảnh hưởng lên sự hiện các gen EPS8, BCAR1, CBL, NCK2 và SHC1 của con đường tín hiệu này ở mức độ phiên mã.
4. ATRA đã điều hòa giảm sự hoạt động của con đường tín hiệu
JAK/STAT, thơng qua điều hịa giảm sự biểu hiện của các gen GAB1, GAB2, SRC, STAT1 và STAT3 ở mức độ phiên mã.
5. Ở con đường apoptosis, ATRA làm giảm sự biểu hiện của các gen ức
chế apoptosis: AKT1, NUP62, BCL2, MAPK1 và tăng cường biểu hiện của các gen thúc đẩy apoptosis: CASP9, FOX3, IL2, P53 ở mức độ phiên mã.
Kết luận chung: ATRA đã ức chế sự sinh trưởng và phát triển các tế bào
ung thư dạ dày MKN45 thơng qua điều hồ làm giảm biểu hiện các gen chủ chốt của hai con đường tín hiệu EGF, JAK/STAT và thúc đẩy quá trình apoptosis.
2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các gen thuộc các con đường tín hiệu EGF, JAK/STAT, apoptosis ở mức độ protein.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Akulapalli S. (2009), History of Cancer, Ancient and Modern Treatment Methods, doi: 10.4172/1948-5956.100000e2.
2. Alam S.M., Rajendran M., Ouyang S., Veeramani S., Zhang L., Lin M.F. (2009), “ novel role of Shc adaptor proteins in steroid hormone- regulated cancers”, Endocr Relat Cancer, 16(1), pp. 1-9.
3. Ali R.Y., Kamran B.L., Peivand B., Maryam R., Zahra K. (2018), “Risk Factors for Gastric Cancer: A Systematic Review”, Asian Pac J Cancer Prev, 19(3), pp. 591–603.
4. Arisi M..F, Starker R.A., Addya S., Huang Y., Fernandez S.V. (2014), “All transretinoic acid (ATRA) induces re-differentiation of early transformed breast epithelial cells”, Int J Oncol, 44, pp. 1831–42.
5. Avalle L., Camporeale A., Camperi A., Poli V. (2017), “STAT3 in cancer: A double-edged sword”, Cytokine, 98, pp. 42–50.
6. Barker N., Huch M., Kujala P., van de Wetering M., Snippert H.J., van Es J.H., et al (2010), “Lgr5+ve stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro”, Cell Stem Cell, 6,
pp. 25–36.
7. Barrett A., Pellet-Many C., Zachary I.C., Evans I.M., Frankel P. (2013), "p130Cas: a key signalling node in health and disease", Cell.
Signal, 25(4), pp. 766–77.
8. Bhardwaj A., Singh S., Srivastava S.K., Arora S., Andrews J., Grizzle