CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Con đường tín hiệu EGF
Sự dẫn truyền thơng tin là q trình tế bào tiếp nhận các tín hiệu thơng tin từ mơi trường và truyền đạt lại thông tin thông qua một loạt các phân tử trong tế bào, tiếp đến là sự đáp ứng lại các tín hiệu đó thơng qua các cơ chế khác nhau. Các con đường tín hiệu tế bào được hoạt hóa bởi nhiều phân tử khác nhau từ phức hệ tế bào hay từ sự kết nối tế bào- tế bào, chúng tham gia điều hịa các q trình của tế bào như sinh tổng hợp protein, sự phát triển và biệt hóa tế bào, kiểm sốt chu trình chết tế bào. Sự rối loạn điều hịa các con đường tín hiệu làm thay đổi các đặc điểm di truyền hoặc di truyền ngoại sinh của tế bào đồng thời gây ra những thay đổi ở phức hệ ngoại màng (extracellular matrix), dẫn tới sự phát triển và lan rộng của khối u [78].
EGFR (epidermal growth factor receptor) thuộc họ thụ thể tyrosine kinase. EGFR hay còn được biết đến với tên ErbB (Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog), bao gồm 4 thụ thể: EGFR (ErbB-1/HER1), ErbB- 2 (Neu, HER2), ErbB-3 (HER3) và ErbB-4 (HER4). Ở động vật có vú, có 7 phối tử liên kết và kích hoạt EGFR: EGF, TGF-α, HB-EGF, betacellulin (BTC), ameraldgulin (ISG), epiregulin (EREG) và epigen (EPGN). Trong đó, EGF, TGF-α, HB-EGF và BTC là các phối tử có ái lực cao với EGFR; trong khi ISG, EREG và EPGN là các phối tử có ái lực thấp với EGFR. Các thụ thể EGFR liên kết thành từng cặp trên màng tế bào (Hình 1.9). Sự kích hoạt các thụ thể EGFR bằng cách liên kết với các phối tử của chúng tạo ra khởi đầu của con đường tín hiệu EGF. Đặc biệt, HER2 là thụ thể khơng có phối tử liên kết trực tiếp, tuy nhiên ảnh hưởng của HER2 trong ung thư được đặc biệt quan tâm [54].
Liên kết với phối tử dẫn đến giảm thiểu EGFR và kích hoạt tyrosine kinase của nó. Phosphoryl hóa tiếp theo của dư lượng tyrosine của EGFR cung cấp vị trí lắp ghép cho protein với các miền SH2 và PTB, kích hoạt sự tải nạp tín hiệu thơng qua kinase protein được kích hoạt Ras-Raf- mitogen/kinase 1/2 (MAPK/ERK1/2), phosphoinositide 3-kinase, AKT, Src họ kinase (SFKs), STATs, phospholipase Cγ1, Rho họ GTPase và các con đường tín hiệu khác. Thơng qua các con đường tín hiệu nội bào được kích hoạt, tín hiệu EGF có ảnh hưởng đến các q trình tăng sinh, di động tế bào, biệt hóa và sống sót của tế bào. Hơn nữa, tín hiệu EGF có thể trực tiếp kiểm sốt chu kì tế bào thơng qua sự dịch chuyển thụ thể vào nhân tế bào. Sự tăng cường hoạt động của tín hiệu EGF cũng đã được chứng minh là có khả năng bảo vệ tế bào khỏi q trình apoptosis [44].
Tín hiệu EGF được kích hoạt bất thường hoặc biểu hiệu bất thường trong nhiều bệnh khác nhau. Vai trị của tín hiệu EGF trong ung thư chưa được hiểu rõ hoàn toàn, tuy nhiên, sự bất thường của tín hiệu EGF được nghiên cứu khá kĩ trong quá trình phát triển của ung thư. Ngoài các dạng đột biến, sự biểu hiện quá mức của tín hiệu EGF cũng thúc đẩy sự tiến triển của ung thư cũng được nghiên cứu ở các dạng ung thư khác nhau như: ung thư biểu mô, sarcomas, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC), ung thư thần kinh ác tính. Sự biểu hiện quá mức của tín hiệu EGF là một mục tiêu nghiên cứu chính trong tiên lượng và điều trị ung thư [16]. Ở ung thư dạ dày, sự biểu hiện quá mức cũng như các đột biến của các gen thuộc con đường tín hiệu EGF đã được nghiên cứu và sử dụng trong chuẩn đoán. Matuzumab, panitumumab, trastuzumab và cisplatin là các loại thuốc được sử dụng phổ biến, mang lại nhiều hiệu quả tích cực trong điều trị nhắm đích con đường tín hiệu EGF trong ung thư dạ dày [43].
Hình 1.9. Con đường tín hiệu của họ thụ thể EGFR (Nguồn: Thermo Fisher) 1.4. Con đường tín hiệu JAK/STAT
Con đường tín hiệu JAK/STAT (Janus kinases - Signal Transducer and Activator of Transcription proteins) là một cơ chế điều hịa sao chép gen, có ở nấm mốc, giun, ruồi, động vật có xương sống nhưng khơng có ở nấm và thực vật. Con đường JAK/STAT liên quan đến tăng trưởng tế bào, biệt hóa, apoptosis và các chức năng quan trọng khác của tế bào. Con đường JAK/STAT điều chỉnh sự phát triển phơi và tham gia vào việc kiểm sốt các quá trình như duy trì tế bào gốc, tạo máu và phản ứng viêm. Con đường dẫn truyền tín hiệu từ các cytokine, interleukin và các yếu tố tăng trưởng hoạt động thông qua một số họ thụ thể xuyên màng đến JAK sau đó kích hoạt STAT, các STAT liên kết với trình tự khởi đầu và điều chỉnh quá trình phiên mã các gen kiểm sốt các q trình tế bào, bao gồm tăng sinh, biệt hóa và apoptosis (Hình 1.10). Con đường JAK/ STAT cung cấp một cơ chế trực tiếp chuyển đổi tín hiệu ngoại bào thành phản ứng sao chép. Tín hiệu JAK/STAT cũng có liên quan tới hàng loạt các con đường tín hiệu tế bào khác như: EGF, Ras/Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT và apoptosis [28].
So với các con đường tín hiệu tế bào khác, con đường tín hiệu JAK/STAT tương đối đơn giản với ít thành phần. Protein JAK và STAT là 2 thành phần cốt lõi của con đường tín hiệu JAK/STAT. Ở động vật có xương sống, có 4 protein JAK là JAK1, JAK2, JAK3 và TYK2; có 7 protein STAT bao gồm: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B và STAT6, chủ yếu đóng vai trị là yếu tố phiên mã. Một loạt các phối tử bao gồm cytokine, hormone và các yếu tố tăng trưởng cùng các thụ thể tương ứng kích thích con đường JAK / STAT. Các protein JAK được kích hoạt khi các phối tử gắn vào các thụ thể của chúng trên bề mặt tế bào. Các phối tử khác nhau kích hoạt các JAK/ STAT khác nhau. Các JAK được kích hoạt sẽ làm thay đổi cấu trúc của các protein STAT giúp cho 2 STAT liên kết với nhau tạo thành một dimer. Các dimer ở tế bào chất di chuyển vào nhân liên kết với DNA của gen đích [28].
Giống với các yếu tố phiên mã khác, STAT có khả năng kết hợp với các đồng kích hoạt (coactivator) như CBP (CREB-binding protein) và p300 (histone acetyltransferase p300) để làm tăng tốc độ phiên mã của gen đích. Các yếu tố đồng kích hoạt này có thể giúp tăng tốc độ phiên mã là nhờ khả năng có thể tạo các điều kiện thuận lợi cho q trình phiên mã. Con đường tín hiệu JAK/STAT có thể liên kết với các con đường tín hiệu khác như PI3K/AKT/mTOR và MAPK/ERK. Sự điều chỉnh con đường tín hiệu JAK/STAT được thực hiện nhờ ba nhóm protein là các chất ức chế protein của STAT hoạt hóa (PIAS), protein tyrosine phosphatase (PTPs) và ức chế tín hiệu cytokine (SOCS) [28].
Sự rối loạn trong hoạt động của con đường tín hiệu JAK/STAT có thể dẫn đến nhiều bệnh liên quan đến hệ thống miễn dịch và ung thư. Mức độ kích hoạt STAT cao có liên quan đến ung thư, đặc biệt kích hoạt STAT3 và STAT 5 cao gây ra các khối u nguy hiểm hơn. Hoạt động của STAT3 cao quá mức liên quan đến tái phát khối u sau điều trị ở ung thư da [66]. Hoạt động quá mức của STAT3 cho phép phiên mã các gen như BCL2, c- Myc có liên quan đến sự phân chia tế bào (Hình 1.11). Đột biến trong gen JAK2 có thể dẫn tới leukemia và lymphoma. Cụ thể hơn, các đột biến ở exon 12, 13, 14 và
15 của gen JAK2 là một yếu tố gây nguy cơ phát triển trong leukemia và lymphoma [48]. Ngoài ra, STAT3 và STAT5 bị đột biến có thể làm tăng tín hiệu JAK/STAT trong các tế bào NK và T, thúc đẩy tăng sinh tế bào, gây nguy cơ tiến triển của leukemia [32]. Hơn nữa, sự hoạt động của STAT3 và STAT5 đã được chứng minh là có khả năng ức chế apoptosis, một dấu hiệu đặc trưng của ung thư [28]. Các phương pháp điều trị nhắm đích tín hiệu JAK/STAT với thuốc nhắm mục tiêu phân tử và can thiệp RNA (RNAi) đã được nghiên cứu rộng rãi. Trong đó, ruxolitinib, tofacitinib và fludarabine là những thuốc nhắm đích tín hiệu JAK/STAT duy nhất được sử dụng trong các phịng khám [28].
Hình 1.10. Con đường tín hiệu JAK/STAT (Nguồn Thermo Fisher)
Ở ung thư dạ dày, rối loạn điều hịa con đường tín hiệu JAK/STAT liên quan mật thiết với protein CagA của vi khuẩn H. pylori [54]. Hơn nữa, nhiễm
H. pylori liên quan đến tăng biểu hiện cytokine, đặc biệt là interleukin-6 (IL
kích hoạt con đường tín hiệu IL6-JAK/STAT3 rất quan trọng cho sự phát triển của ung thư dạ dày. Kích hoạt STAT3 rất quan trọng cho sự khởi đầu và tiến triển của ung thư dạ dày. Việc kích hoạt STAT3 cũng được xác định xảy ra mạnh mẽ hơn ở các bệnh nhân ung thư dạ dày nhiễm H. pylori dương tính CagA [45]. Trong ung thư dạ dày, các thuốc nhắm mục tiêu phân tử con đường tín hiệu JAK/STAT hiện nay chủ yếu tập trung vào nhắm đích JAK1/JAK2 và STAT3. Các thuốc ức chế JAK1/JAK2 như: INCB018424, TG101348, CEP701, AZD1480 đang trong giai đoạn thử nghiệm trên người đem lại những tín hiệu tích cực trong việc ức chế sự phát triển của khối u và cảm ứng apoptosis [49]. Thuốc WP-1066 cũng đã được thử nghiệm trên mô hình ung thư dạ dày là chuột gp757FF và dịng tế bào AGS. Kết quả thử nghiệm cho thấy sự tăng sinh của các tế bào đã bị chặn, tình trạng viêm giảm và quá trình apoptosis được tạo ra nhờ cảm ứng ức chế STAT3 [17].
1.5. Khái quát về apoptosis
Apoptosis hay còn gọi là sự chết tế bào được lập trình, là một cơ chế phức tạp ở mức độ gen để loại bỏ các tế bào bị hư hỏng có trật tự và hiệu quả như những tế bào sau khi bị tổn thương DNA hay do sai lệch trong quá trình phát triển. Các thành phần của apoptosis rất phức tạp và có liên quan đến nhiều con đường tín hiệu tế bào trong đó có con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT. Sự ức chế các con đường tín hiệu liên quan đến sự phát triển của tế bào làm tế bào dễ dàng đi vào quá trình apoptosis [90]. Q trình apoptosis trong một tế bào có thể được kích hoạt thơng qua con đường ngoại sinh - extrinsic apoptotic pathway (phụ thuộc death receptor) hoặc con đường nội sinh - intrinsic apoptotic pathway (phụ thuộc ty thể). Cả hai con đường này hội tụ để kích hoạt các apoptotic effector dẫn đến cuối cùng là sự thay đổi tế bào với các đặc điểm đặc trưng và hình dạng, đặc điểm sinh hóa của apoptosis [90]. Thông thường, sự cân bằng giữa các chất điều hòa protein pro-apoptotic và anti apoptotic là một điểm quan trọng để xác định quá trình apoptosis ở một tế bào. Việc gây ra apoptosis do tổn thương DNA trong các tổn thương tiền ung thư có thể loại bỏ các tế bào có hại, do đó ngăn chặn sự phát triển của khối u. Sự ức chế apoptosis có liên quan đến tăng sinh tế bào khơng được kiểm sốt, sự phát triển và tiến triển của ung thư và khả năng kháng thuốc trong điều trị. Sự ức chế apoptosis được coi là một trong những dấu hiệu đặc trưng của bệnh ung thư [34].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu
Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 do phịng Thí nghiệm Inserm U1053 - Viện Sức khỏe và Nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp tại Bordeaux cung cấp.
Nhóm đối chứng là các tế bào MKN45 được xử lý bằng DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian 48 giờ.
Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy DMEMF12 và RPMI1640 (Invitrogen cung cấp), huyết thanh bò, trypsin, kháng sinh Penicillin/Streptomycin, DMSO (Sigma cung cấp). Các đĩa nuôi cấy tế bào, ống pipette và một số dụng cụ nhỏ khác do Thermo Fisher cung cấp.
All trans retionic acid được cung cấp bởi hãng Sigma Aldrick (Pháp) với mã sản phẩm 2625.
Các hóa chất sử dụng trong tách chiết RNA và phản ứng Realtime PCR: RNeasy Mini Kit (Qiagen), Quantitect Reverse Transcriptase (RT) Kit (Qiagen), TOPreal qPCR 2X PreMix SYBR (Invitrogen).
Các primer dùng trong phân tích mức độ biểu hiện gen do hãng Qiagen cung cấp.
Các thí nghiệm được triển khai trên các hệ thống trang thiết bị gồm máy Realtime PCR (Analytic gena), hệ thống nuôi cấy tế bào (Memmert), buồng thao tác sinh học an toàn sinh học cấp 2 (Thermo Fisher) và các trang thiết bị phụ trợ khác tại phịng Thí nghiệm Y sinh – Trường Đại học Khoa học.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện tại phịng Thí nghiệm Y Sinh – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D
100.000 tế bào ung thư dạ dày dịng MKN45 được ni cấy trong hộp ni cấy diện tích 75 cm2, trong mơi trường ni cấy RPMI 1640 (Invitrogen) bổ sung 10% huyết thanh bò và kháng sinh 1% penicilline/streptomycine.
Môi trường nuôi cấy được thay ngày một lần bằng một môi trường nuôi cấy mới. Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với trypsine 0,05% trong 3 phút. Tế bào được thu lại bằng ly tâm 1.300 rpm trong 5 phút và được cấy chuyển sang một bình ni cấy mới. Tế bào sống, chết được đếm dưới kính hiển vi đảo ngược, sử dụng trypan blue làm thuốc nhuộm cho tế bào chết. Hình ảnh tế bào được chụp ảnh bằng kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipse 2.
2.3.2. Phương pháp ni cấy tế bào 3D và xử lí tế bào với ATRA
Ni cấy các tế bào ung thư dạ dày MKN45 với mật độ 2.000 tế bào/giếng ni cấy có diện tích 3,8 cm2, bề mặt khơng bám dính để hình thành nên tumorsphere (khối tế bào ung thư hình cầu). Sử dụng mơi trường DMEMF12/Glutamax có bổ sung 1% ampinicillin/streptomycin, yếu tố tăng trưởng biểu mô EGF 20 ng/ml, yếu tố tăng trưởng thượng bì FGF 20ng/ml, 0,3% glucose, 5µg/ml insulin ở 370C, 5% CO2. Mỗi 2 ngày của q trình ni cấy, loại bỏ 1 ml môi trường nuôi cấy cũ, đồng thời bổ sung 1 ml môi trường nuôi cấy mới.
Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với ATRA ở nồng độ 5µM (nồng độ ức chế sự tăng sinh tế bào được lựa chọn từ một sàng lọc trong giải nồng độ từ 0 – 10µM trước khi tiến hành nghiên cứu) trong 48 giờ. Mẫu đối chứng được xử lý bằng DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian tương ứng với mẫu xử lý ATRA. Thu nhận và phân tách các tumorsphere thành các tế bào đơn bằng enzyme trypsine nồng độ 0,05% trước khi tách chiết RNA tổng số (hóa chất được cung cấp bởi Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France).
2.3.3. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA
RNA tổng số của tế bào MKN45 được tách chiết bằng Trizol theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Tế bào nuôi cấy trên đĩa 6 giếng được bổ sung 1000µl Trizol, dùng pipette 1ml mix nhiều lần để tách tế bào ra khỏi bề mặt đĩa. Ủ tế bào ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút ở 40C. Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới.
Bổ sung 2ml chloroform, vontex mẫu trong 15 giây và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Ly tâm 10.000 rpm trong 15 phút ở 40C. Hút thận trọng dung dịch pha trên cùng sang một ống eppendoft mới. Bổ sung 500µl Isopropanol và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phịng sau đó ly tâm 10.000 rpm trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và rửa RNA bằng 1ml ethanol 75% bằng cách ly tâm 7.000 rpm trong 5 phút ở 40C, lặp lại 2 lần. Làm khơ RNA trong 5-10 phút và bổ sung 100 µl nước khử ion.
Đo quang phổ tại các bước sóng 260/280nm bằng máy đo quang phổ NanoDrop. Sử dụng 1µg RNA để tạo cDNA bằng Quantitect Reverse Transcriptase (RT) kit (do Quiagen, Hilden, Germany cung cấp) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.3.4. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu EGF bằng Realtime PCR
Phân tích Realtime PCR sử dụng 20ng cDNA cho mỗi phản ứng PCR với tổng thể tích là 20 µl với chất phát huỳnh quang SYBR Green qPCR do Invitrogen cung cấp. Danh sách các gen nghiên cứu với mã số cặp mồi tương