2.1. Vật liệu nghiên cứu
Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 do phịng Thí nghiệm Inserm U1053 - Viện Sức khỏe và Nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp tại Bordeaux cung cấp.
Nhóm đối chứng là các tế bào MKN45 được xử lý bằng DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian 48 giờ.
Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy DMEMF12 và RPMI1640 (Invitrogen cung cấp), huyết thanh bò, trypsin, kháng sinh Penicillin/Streptomycin, DMSO (Sigma cung cấp). Các đĩa nuôi cấy tế bào, ống pipette và một số dụng cụ nhỏ khác do Thermo Fisher cung cấp.
All trans retionic acid được cung cấp bởi hãng Sigma Aldrick (Pháp) với mã sản phẩm 2625.
Các hóa chất sử dụng trong tách chiết RNA và phản ứng Realtime PCR: RNeasy Mini Kit (Qiagen), Quantitect Reverse Transcriptase (RT) Kit (Qiagen), TOPreal qPCR 2X PreMix SYBR (Invitrogen).
Các primer dùng trong phân tích mức độ biểu hiện gen do hãng Qiagen cung cấp.
Các thí nghiệm được triển khai trên các hệ thống trang thiết bị gồm máy Realtime PCR (Analytic gena), hệ thống nuôi cấy tế bào (Memmert), buồng thao tác sinh học an toàn sinh học cấp 2 (Thermo Fisher) và các trang thiết bị phụ trợ khác tại phịng Thí nghiệm Y sinh – Trường Đại học Khoa học.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện tại phịng Thí nghiệm Y Sinh – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D
100.000 tế bào ung thư dạ dày dịng MKN45 được ni cấy trong hộp ni cấy diện tích 75 cm2, trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (Invitrogen) bổ sung 10% huyết thanh bò và kháng sinh 1% penicilline/streptomycine.
Môi trường nuôi cấy được thay ngày một lần bằng một môi trường nuôi cấy mới. Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với trypsine 0,05% trong 3 phút. Tế bào được thu lại bằng ly tâm 1.300 rpm trong 5 phút và được cấy chuyển sang một bình ni cấy mới. Tế bào sống, chết được đếm dưới kính hiển vi đảo ngược, sử dụng trypan blue làm thuốc nhuộm cho tế bào chết. Hình ảnh tế bào được chụp ảnh bằng kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipse 2.
2.3.2. Phương pháp ni cấy tế bào 3D và xử lí tế bào với ATRA
Ni cấy các tế bào ung thư dạ dày MKN45 với mật độ 2.000 tế bào/giếng ni cấy có diện tích 3,8 cm2, bề mặt khơng bám dính để hình thành nên tumorsphere (khối tế bào ung thư hình cầu). Sử dụng mơi trường DMEMF12/Glutamax có bổ sung 1% ampinicillin/streptomycin, yếu tố tăng trưởng biểu mô EGF 20 ng/ml, yếu tố tăng trưởng thượng bì FGF 20ng/ml, 0,3% glucose, 5µg/ml insulin ở 370C, 5% CO2. Mỗi 2 ngày của q trình ni cấy, loại bỏ 1 ml môi trường nuôi cấy cũ, đồng thời bổ sung 1 ml môi trường nuôi cấy mới.
Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với ATRA ở nồng độ 5µM (nồng độ ức chế sự tăng sinh tế bào được lựa chọn từ một sàng lọc trong giải nồng độ từ 0 – 10µM trước khi tiến hành nghiên cứu) trong 48 giờ. Mẫu đối chứng được xử lý bằng DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian tương ứng với mẫu xử lý ATRA. Thu nhận và phân tách các tumorsphere thành các tế bào đơn bằng enzyme trypsine nồng độ 0,05% trước khi tách chiết RNA tổng số (hóa chất được cung cấp bởi Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France).
2.3.3. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA
RNA tổng số của tế bào MKN45 được tách chiết bằng Trizol theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Tế bào nuôi cấy trên đĩa 6 giếng được bổ sung 1000µl Trizol, dùng pipette 1ml mix nhiều lần để tách tế bào ra khỏi bề mặt đĩa. Ủ tế bào ở nhiệt độ phịng trong 5 phút, sau đó ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút ở 40C. Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới.
Bổ sung 2ml chloroform, vontex mẫu trong 15 giây và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Ly tâm 10.000 rpm trong 15 phút ở 40C. Hút thận trọng dung dịch pha trên cùng sang một ống eppendoft mới. Bổ sung 500µl Isopropanol và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phịng sau đó ly tâm 10.000 rpm trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và rửa RNA bằng 1ml ethanol 75% bằng cách ly tâm 7.000 rpm trong 5 phút ở 40C, lặp lại 2 lần. Làm khô RNA trong 5-10 phút và bổ sung 100 µl nước khử ion.
Đo quang phổ tại các bước sóng 260/280nm bằng máy đo quang phổ NanoDrop. Sử dụng 1µg RNA để tạo cDNA bằng Quantitect Reverse Transcriptase (RT) kit (do Quiagen, Hilden, Germany cung cấp) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.3.4. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu EGF bằng Realtime PCR
Phân tích Realtime PCR sử dụng 20ng cDNA cho mỗi phản ứng PCR với tổng thể tích là 20 µl với chất phát huỳnh quang SYBR Green qPCR do Invitrogen cung cấp. Danh sách các gen nghiên cứu với mã số cặp mồi tương ứng do Quiagen cung cấp và được trình bày trong bảng 2.1. Sự thay đổi về mức độ biểu hiện gen được tính theo phương pháp Delta delta ct (ΔΔCt). Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình của 3 lần lặp lại của thí nghiệm với độ lệch chuẩn SD, cỡ mẫu cho mỗi lần thí nghiệm n=3.
Dữ liệu được thống kê và phân tích bằng phần mềm SPSS16.0F, sử dụng kiểm định Mann-Whitney.
Bảng 2.1. Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu EGF
Tên gen Mã số cặp mồi
GAB2 PPH05872A NUP62 PPH23942A RPS6KA5 PPH01791A EPS8 PPH07120A BCAR1 PPH01530A CBL PPH00089F EGFR PPH00138B NCK2 PPH01626B SHC1 PPH00229B
2.3.5. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu JAK/STAT bằng Realtime PCR JAK/STAT bằng Realtime PCR
Bảng 2.2. Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu JAK/STAT
Tên gen Mã số cặp mồi
GAB1 PPH02307B SRC PPH00103C GAB2* PPH05872A STAT3 PPH00708F PPP2CA PPH02088C STAT1 PPH00811C
Thành phần phản ứng Realtime PCR gồm 15µl chứa 20µg cDNA, 3µM mồi đặc hiệu tương ứng với gen nghiên cứu, sử dụng chất phát quang SYNBER Green (Invitrogen). Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của tối thiểu 3 thí nghiệm với độ lệch chuẩn SD. Dữ liệu được thống kê và phân tích bằng phần mềm SPSS16.0F, sử dụng kiểm định Mann-Whitney.
2.3.6. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường apoptosis bằng Realtime PCR bằng Realtime PCR
Phân tích Realtime PCR sử dụng 20ng cDNA cho mỗi phản ứng PCR với tổng thể tích là 20 µl với chất phát huỳnh quang SYBR Green qPCR do Invitrogen cung cấp. Danh sách các gen nghiên cứu với mã số cặp mồi tương ứng do Quiagen cung cấp và được trình bày trong bảng 2.3. Sự thay đổi về mức độ biểu hiện gen được tính theo phương pháp Delta delta ct (ΔΔCt). Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình của 3 lần lặp lại của thí nghiệm với độ lệch chuẩn SD, cỡ mẫu cho mỗi lần thí nghiệm n=3.
Dữ liệu được thống kê và phân tích bằng phần mềm SPSS16.0F, sử dụng kiểm định Mann-Whitney.
Bảng 2.3. Mã số cặp mồi của các gen trong con đường apoptosis
Gen Mã số cặp mồi Gen ức chế apoptosis AKT1 NUP62** BCL2 MAPK1 PPH00088B-200 PPH23942A PPH00079B PPH00715B Gen thúc đẩy apoptosis CASP9 FOXO3 IL2 TP53 PPH00353B PPH00807A PPH00172C PPH00213F