Mẫu sinh phẩm

CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Mẫu sinh phẩm

Nghiên cứu này sử dụng 60 mẫu máu của bệnh nhân nữ, được khẳng định mắc ung thư vú. Các mẫu máu của người bệnh được lấy từ bệnh viện Đa khoa Phú Thọ trong khoảng thời gian từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 5 năm 2017. Đồng thời, 50 mẫu máu của những người khoẻ mạnh được sử dụng là mẫu đối chứng. 50 mẫu máu đối chứng được cung cấp bởi viện Huyết học và Truyền máu Trung ương trong thời gian tháng 8 năm 2016. Các mẫu máu được bảo quản tại nhiệt độ -200C cho đến khi làm thí nghiệm. Việc lấy mẫu nghiên cứu tuân thủ các quy định về y đức.

Bảng 4: Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ các mẫu nghiên cứu Tiêu chuẩn Nhóm mắc bệnh Nhóm đối chứng

Lựa chọn

- Được chẩn đoán mắc ung thư vú

- Chưa qua điều trị nội tiết, bức xạ hoặc hố trị

- Trước đây khơng có khới u ác tính nào khác

- Đồng ý cung cấp mẫu máu cho nghiên cứu

- Là phụ nữ khoẻ mạnh - Đồng ý cung cấp mẫu

máu cho nghiên cứu

Loại trừ

- Đã từng được điều trị bằng liệu pháp hormone

- Có những rới loạn chức năng ở tim, phổi, gan, thận hoặc rối loạn nghiêm trọng về chức năng nội tạng khác

- Đã từng được điều trị bằng liệu pháp hormone - Đang trong thời kỳ mang

thai hoặc cho con bú - Có những rới loạn chức

năng ở tim, phổi, gan, thận hoặc các cơ quan khác trước đó

2.1.2. Hoá chất

Trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng các hố chất sau: bộ kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega Corporation, USA), enzyme cắt giới hạn SduI (Thermo Scientific), hoá chất cho phản ứng PCR (Bảng 5 và Bảng 8), agarose, đệm điện di TAE 1X.

2.1.3. Trang thiết bị

Các thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phịng thí nghiệm Di trùn, Đại học Khoa học Tự nhiên–Đại học Quốc gia Hà Nội: máy PCR; máy điện di, bể ổn nhiệt, máy li tâm, máy spin, máy chụp geldoc.

2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Với mục tiêu đã xác định, để thực hiện các nội dung nghiên cứu, các bước nghiên cứu được tiến hành như sơ đồ thí nghiệm ở Hình 9 dưới đây.

Từ kết quả chẩn đoán lâm sàng của Bệnh viện Đa khoa Phú Thọ, Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, chúng tôi thu 60 mẫu máu của phụ nữ được chẩn đoán mắc ung thư vú và 50 mẫu máu của phụ nữ khỏe mạnh để tiến hành tách chiết ADN bằng bộ kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega Corporation, USA) (1). ADN được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di và xác định nồng độ bằng phương pháp đo phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm (OD260) (2). ADN tởng sớ đạt yêu cầu được PCR với cặp mồi F/R nhân vùng trình tự dài 202 bp có SNP rs10046 của gen CYP19A1, sau đó tiến hành phản ứng với enzyme cắt giới hạn FastDigestSduI (3). Điện di sản phẩm của phản ứng PCR và sản phẩm của phản ứng cắt với enzyme giới hạn để xác định SNP rs10046 trên gen CYP19A1 (4). ADN tổng số đạt yêu cầu được tiến hành phản ứng PCR–CTPP với 2 cặp mồi đặc hiệu: F1/R1–F2/R2 (5). Điện di sản phẩm của phản ứng PCR–CTPP để xác định kiểu gen CYP19A1 tại SNP rs2236722 (6). Sau khi xác định được kiểu gen CYP19A1 tại SNP rs10046 và SNP rs2236722, lựa chọn một số mẫu sản phẩm của phản ứng PCR với cặp mồi F/R và một số mẫu sản phẩm phản ứng PCR với cặp mồi F1/R2 đi tinh sạch và gửi giải trình tự (7). Thớng kê kết quả và phân tích mới liên hệ giữa SNP rs10046 và SNP rs2236722 của gen CYP19A1 và nguy cơ mắc ung thư vú ở

phụ nữ Việt Nam (8).

2.2.2. Tách ADN từ mẫu máu

Máu tĩnh mạch của đối tượng nghiên cứu được chống đông bằng EDTA. ADN tổng số được tách chiết từ mẫu máu bằng bộ kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega Corporation, USA) . Các bước thực hiện như sau:

Bước đầu tiên, thêm 900μl dung dịch Cell Lysic Solution vào ống 1,5 ml đã tiệt trùng rồi lắc nhẹ. Sau đó, chuyển 300 μl máu sang ống chứa dung dịch Cell Lysic Solution, tiếp tục đảo ống nhẹ nhàng 5–6 lần để trộn đều. Ủ dung dịch đã trộn 10 phút ở nhiệt độ phịng và đảo ớng 2–3 lần khi ủ. Ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 20 giây ở nhiệt độ phịng. Tiếp đó, loại bỏ tới đa dung dịch nởi

nhưng khơng chạm vào hạt trắng có thể nhìn thấy ở đáy ống, để lại khoảng 20 μl dung dịch rồi thêm 100 μl dung dịch Cell Lysis Solution, sau đó ly tâm và loại dịch nổi, để lại khoảng 20 μl dung dịch. Tiếp tục thêm 300 μl dung dịch Nuclei Lysis Solution, vortex cho tới khi tan kết tủa. Ủ dung dịch ở 37C trong 30 phút cho tới khi kết tủa tan hoàn toàn, rồi lấy ra làm mát ở nhiệt độ phịng (ít nhất 5 phút). Sau đó, thêm 1,5 μl dung dịch RNase Soulution vào và trộn mẫu bằng cách đảo đầu ống 2–5 lần. Ủ hỗn hợp ở 37C trong 15 phút, làm mát ở nhiệt độ phịng ít nhất là 5 phút. Thêm 100 μl dung dịch Protein Precipitation (có thể thấy kết tủa protein) rồi vortex mạnh trong 10–20 giây. Ly tâm ở 13.000–16.000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng (xuất hiện kết tủa màu nâu ở đáy ống ), cho 300 μl isopropanol ở nhiệt độ phịng vào ớng 1,5 ml vơ trùng mới. Chuyển dung dịch nổi sau khi ly tâm vào ống chứa isopropanol (chú ý không hút hết dung dịch và để đầu pipet chạm vào kết tủa protein tránh nhiễm ADN với kết tủa). Trộn nhẹ nhàng dung dịch bằng cách đảo đầu cho tới khi có thể nhìn thấy vẩn tủa là các sợi ADN màu trắng. Ly tâm ở 13.000–16.000 vịng/phút (có thể thấy hạt ADN vẩn tủa màu trắng). Gạn bỏ dung dịch nổi, thấm dung dịch trên thành ống sau khi gạn. Thêm 300 μl cồn 70% ethanol ở nhiệt độ phòng, đảo nhẹ ống vài lần để rửa kết tủa ADN. Ly tâm 14.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng rồi hút cẩn thận dung dịch ethanol bằng pipet. Đảo ống đặt trên giấy thấm và làm khô hạt tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 100 μl dung dịch ADN Rehydration Soulution vào ống. Để dung dịch qua đêm ở 40C (hoặc ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng; hoặc ủ dung dịch ở 65C trong 1 giờ, phải trộn dung dịch bằng cách búng nhẹ vào ống). Cuối cùng, bảo quản ADN ở -20C.

2.2.3. Phương pháp đo nồng độ quang học

Xác định nồng độ ADN

Nồng độ và độ sạch của ADN tổng số được xác định bằng cách đo độ

hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Nồng độ ADN được tính theo cơng thức:

[ADN] = A260 x n x 50 (g/ml) Trong đó: A260 : độ hấp thụ của ADN ở bước sóng 260 nm

n : sớ lần pha lỗng mẫu

50 : nồng độ ADN tương ứng khi A260 = 1

2.2.4. Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng hầu hết trong các phịng thí nghiệm sinh học phân tử. Nguyên tắc chính của kỹ thuật này là sử dụng enzym ADN polymerase chịu nhiệt để nhân đoạn ADN với cặp mồi đặc hiệu ở đầu 3’ của ADN sợi khn. Chu kỳ phản ứng PCR có 3 giai đoạn chính: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn mồi, giai đoạn kéo dài mạch ADN.  

Trình tự mồi được sử dụng cho PCR các đoạn gen CYP19A1 mang các vị trí SNP trong nghiên cứu này được tham khảo từ nghiên cứu của L.Yang và cs năm 2015 [70], được trình bày ở Bảng 5.

Bảng 5: Trình tự mồi cho phản ứng PCR

Mồi Trình tự

Mồi xuôi F 5'-CTGGAACACTAGAGAAGGCTGGTCAGTGC-3' Mồi ngược R 5'-GTTCTCTGGTGTGAACAGGAGATGAC-3'

Sản phẩm PCR là một đoạn ADN kích thước 202 bp được khuếch đại. Điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR được trình bày ở Bảng 6

Bảng 6: Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR

Thành phần Thể tích (l) Điều kiện PCR ADN 1 Chu trình nhiệt: 94oC–2 phút; 35 chu kỳ [94oC–30 giây; 59oC–40 giây; 72oC–40 giây]; 72oC–5 phút, giữ nhiệt ở 20oC. DNTPs (2 nM) 2,5 Đệm 10X(20 mM Mg2+) 2,5 Mồi F 1 Mồi R 1

Taq ADN Polymerase (5 u) 0,2

DDW 16,8

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%, đệm TAE 1X trong 30 phút ở 90V, nhuộm với Ethidium Bromide và chụp hình để kiểm tra kết quả.

2.2.5. Kỹ thuật PCR–RFLP

Sản phẩm của phản ứng PCR có chứa SNP rs10046 được ủ với enzyme cắt giới hạn FastDigestSduI. Thành phần và điều kiện tới ưu cho phản ứng cắt được trình bày ở Bảng 7.

Bảng 7: Thành phần và điều kiện phản ứng cắt với enzyme giới hạn Thành phần Thể tích (l)

ADN (sản phẩm PCR) 15

10 fast digest buffer 2

Fast digest enzyme 1

DDW 12

Tổng 30

Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 15 phút

Sản phẩm PCR cắt hồn tồn hoặc khơng cắt với enzyme SduI được điện di trên gel agarose 2% đệm TAE 1X trong 50 phút ở 70V, nhuộm với Ethidium Bromide và chụp hình để kiểm tra kết quả.

Trong nghiên cứu này, SNP rs10046 của gen CYP19A1 được phân biệt dựa vào

các băng đặc trưng được thể hiện trên Hình 10.

2.2.6. Kỹ thuật PCR–CTPP

Trrình tự 2 cặp mồi đối nhau sử dụng trong phản ứng PCR–CTPP ở nghiên cứu này, được tham khảo từ nghiên cứu của Kaoru Hirose và cs (2004) [29], trình bày ở Bảng 8

Bảng 8: Trình tự 2 cặp mồi trong phản ứng PCR–CTPP

Xác định alen C F1 5’-ATCTGTACTGTACAGCACC-3’ R1 5’-ATGTGCCCTCATAATTCCG-3’ Xác định alen T F2 5’-GGCCTTTTTCTCTTGGTGT-3’

R2 5’-CTCCAAGTCCTCATTTGCT-3’ Điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR–CTPP được trình bày ở Bảng 9.

Bảng 9: Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR–CTPP Thành phần Thể tích (l) Điều kiện PCR ADN 1 Chu trình nhiệt: 95oC–10 phút; 30 chu kỳ [95oC–1 phút; 54oC– 1 phút; 72oC–1 phút]; 72oC–5 phút, giữ nhiệt ở 20oC. DNTPs (2 nM) 2,5 Đệm 10X(20 mM Mg2+) 2,5 Mồi F1 1 Mồi R1 1 Mồi F2 1 Mồi R2 1 AmpliTaq Gold (5 u) 0,2 DDW 14,8 Tổng 25

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2% đệm TAE 1X trong 30 phút ở 70V, nhuộm với Ethidium Bromide và chụp hình để kiểm tra kết quả. Trong nghiên cứu này, SNP rs2236722 của gen CYP19A1 được phân biệt dựa vào các

băng đặc trưng được thể hiện trên Hình 11. Băng 200 bp đặc trưng cho alen T, băng 264 bp đặc trưng cho alen C, và một băng chung có kích thước 427 bp.

Hình 11. Kiểu gen tại vị trí SNP rs2236722 của gen CYP19A1 2.2.7. Phương pháp điện di

Điện di gel agarose là một phương pháp rất phở biến và quan trọng để phân tích các phân tử sinh học. Khi có điện trường chạy qua bản gel, phân tử ADN mang nhóm phosphate tích điện âm di chuyển từ cực âm sang cực dương trong điện trường. Tốc độ di chuyển của ADN phụ thuộc vào: kích thước ADN, nồng độ agarose, điện áp sử dụng, ethidium bromide, và dung dịch đệm điện di. Các bước thực hiện:

Đặt lược sẵn ở 1 đầu khuôn, đặt khuôn ở nơi bằng phẳng, dùng miếng bọt khí để kiểm tra. Khi đở gel agarose 1%, cân 1g agarose cho vào bình tam giác 250ml, thêm 100 ml dung dịch TAE 1X. Đổ gel agarose 2%, cân 2g agarose cho vào bình tam giác 250 ml, thêm 100 ml dung dịch TAE 1X. Sau đó lắc nhẹ cho agarose hịa lẫn dung dịch đệm. Đặt bình tam giác vào lị vi sóng đun khoảng 1-2 phút. Khi dung dịch sơi lên và có màu trắng trong, lấy bình tam giác ra, đợi 15 phút thấy vừa nóng (60oC) thì đở nhẹ dung dịch vào khn điện di. Khoảng 45 phút thì agarose đặc lại, gel đởi thành màu trắng đục. Sau đó, lấy

nhẹ lược ra, thêm dung dịch đệm điện di phủ mặt gel khoảng 3–5mm. Trước khi load mẫu vào giếng gel điện di, cần trộn đều mẫu với dung dịch dye theo tỉ lệ 1dye : 6 mẫu, sau đó dùng micropipette nhỏ mẫu vào lần lượt các giếng. Khởi động nguồn điện, chọn điện thế và thời gian, xong nhấn nút Run. Nhuộm gel với Ethidium Bromide và xem gel dưới đèn UV và chụp ảnh.

Trong nghiên cứu này, ADN tổng số được điện di trên gel agarose 1%. Ngoài ra, sản phẩm phản ứng PCR và phản ứng cắt với enzyme SduI được điện di trên gel agarose 2%. Đệm điện di là TAE 1X với thành phần chứa trong 100ml như sau: 1,08 g Tris–base, 0,55 g acid ric, 400 μl EDTA 0,5 M pH 8.

2.2.8. Giải trình tự

Các đoạn trình tự dài 202 bp, 427bp của gen CYP19A1 chứa lần lượt SNP rs10046, SNP rs2236722 được gửi giải trình tự tại hãng 1st BASE DNA Sequencing (Malaysia)

2.2.9. Phương pháp phân tích thống kê

Phần mềm Stata 12 được sử dụng để phân tích thớng kê và xử lý sớ liệu. Tần số của các alen được kiểm tra phân bố theo định luật cân bằng Hardy – Weinberg bằng kiểm định Chi–square test.

Mối liên hệ giữa các SNP trên gen CYP19 và nguy cơ mắc ung thư vú được thể hiện bằng giá trị OR (Odds Ratio). Odds là xác suất mắc bệnh chia cho xác suất không mắc bệnh. Nếu p là xác suất mắc bệnh, thì 1 – p là xác suất khơng mắc bệnh. Theo đó, odds được định nghĩa bằng:

Odds = p 1− p

Odds > 1: Khả năng mắc bệnh cao hơn khả năng không mắc bệnh Odds = 1: Khả năng mắc bệnh bằng với khả năng không mắc bệnh Odds < 1: Khả năng mắc bệnh thấp hơn khả năng không mắc bệnh Odd mắc bệnh trong nhóm có ́u tớ nguy cơ là: Odd1 = p1

1− p1

Odd mắc bệnh trong nhóm khơng có ́u tớ nguy cơ là: Odd2 = p2 1− p2 OR được định nghĩa là tỉ số của hai odds:

OR = Odd1

Odd2 = p1/(1− p1) p2/(1− p2)

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết ADN tổng số 3.1. Tách chiết ADN tổng số

ADN của cả nhóm mắc bệnh và nhóm đới chứng được tách chiết theo quy trình đã trình bày ở mục 2.2.2. Chất lượng ADN tổng số được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được trình bày trên Hình 12. Kết quả điện di cho thấy ADN tách chiết cho băng đậm nét và khơng có vệt băng phụ.

Hình 12. Kết quả điện di ADN tổng số của đại diện một số mẫu nghiên cứu

(gel agarose 1%; M: Marker Lamda HindIII)

Từ kết quả điện di ADN tổng số, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ ADN bằng phương pháp đo quang phổ.

Kết quả cho thấy các mẫu ADN tách chiết đều cho nồng độ tốt, tỷ lệ A260/A280 trong khoảng 1.8 – 2.0 chứng tỏ ADN có độ sạch cao, đạt yêu cầu để sử dụng trong các phản ứng PCR tiếp theo. Kết quả đo OD của đại diện một số mẫu nghiên cứu được trình bày trong Bảng 10.

Bảng 10: Kết quả OD của đại diện một số mẫu ADN tách chiết Mẫu A260/A280 Nồng độ ADN (ng/l)

8B 1,89 62,00 14B 1,86 86,10 21B 1,87 86,50 18C 1,92 61,80 22C 1,91 66,38 37C 1,94 50,38

3.2. Kết quả PCR nhân bản đoạn gen CYP19A1

Kết quả phản ứng PCR của đại diện một số mẫu nghiên cứu được thể hiện ở Hình 13 (A và B) ở cả nhóm bệnh và nhóm đới chứng.

(A)

(B)

Hình 13. Sản phẩm PCR của đại diện một sớ mẫu nghiên cứu (gel agarose

2%, M: marker 100 bp, (-): đới chứng âm)

(A) Kết quả PCR của nhóm bệnh (B) Kết quả PCR của nhóm đới chứng

Đoạn ADN được kh́ch đại có kích thước 202bp, kết quả điện di cho băng rõ nét và duy nhất, chứng tỏ phản ứng nhân bản đoạn ADN là đặc hiệu ở cả các mẫu nhóm bệnh và nhóm chứng.

3.3. Kết quả PCR–RFLP để xác định kiểu gen tại SNP rs10046

Sản phẩm của phản ứng PCR, đoạn ADN được khuếch đại với kích thước 202 bp, được ủ với enzyme cắt giới hạn SduI. Kết quả của phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn được điện di trên gel agarose 2%và thể hiện trên Hình 14 (A và B).

(A)

(B)

Hình 14. Kết quả phản ứng cắt với enzyme giới hạn của đại diện một số mẫu

nghiên cứu (gel agarose 2%, M: marker 100 bp, (-): đối chứng âm)

(A) Kết quả PCR–RFLP của nhóm bệnh. (B) Kết quả PCR–RFLP của nhóm đới chứng.

Kiểu gen đồng hợp tử CC được xác định bằng sự xuất hiện của 2 băng 172 bp và 30 bp. Kiểu gen đồng hợp tử TT được xác định bằng đoạn 202 bp. Kiểu gen dị hợp tử CT được xác định bằng 3 đoạn băng với kích thước 202 bp,

172 bp và 30 bp. Do đoạn băng có kích thước 30 bp là quá nhỏ nên không thể

Ứng dụng và triển vọng của SNP

Gen CYP19A1 và ung thư vú