Tách ADN từ mẫu máu

CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.2. Tách ADN từ mẫu máu

Máu tĩnh mạch của đối tượng nghiên cứu được chống đông bằng EDTA. ADN tổng số được tách chiết từ mẫu máu bằng bộ kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega Corporation, USA) . Các bước thực hiện như sau:

Bước đầu tiên, thêm 900μl dung dịch Cell Lysic Solution vào ống 1,5 ml đã tiệt trùng rồi lắc nhẹ. Sau đó, chuyển 300 μl máu sang ớng chứa dung dịch Cell Lysic Solution, tiếp tục đảo ống nhẹ nhàng 5–6 lần để trộn đều. Ủ dung dịch đã trộn 10 phút ở nhiệt độ phịng và đảo ớng 2–3 lần khi ủ. Ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 20 giây ở nhiệt độ phịng. Tiếp đó, loại bỏ tới đa dung dịch nởi

nhưng khơng chạm vào hạt trắng có thể nhìn thấy ở đáy ớng, để lại khoảng 20 μl dung dịch rồi thêm 100 μl dung dịch Cell Lysis Solution, sau đó ly tâm và loại dịch nởi, để lại khoảng 20 μl dung dịch. Tiếp tục thêm 300 μl dung dịch Nuclei Lysis Solution, vortex cho tới khi tan kết tủa. Ủ dung dịch ở 37C trong 30 phút cho tới khi kết tủa tan hoàn toàn, rồi lấy ra làm mát ở nhiệt độ phịng (ít nhất 5 phút). Sau đó, thêm 1,5 μl dung dịch RNase Soulution vào và trộn mẫu bằng cách đảo đầu ống 2–5 lần. Ủ hỗn hợp ở 37C trong 15 phút, làm mát ở nhiệt độ phịng ít nhất là 5 phút. Thêm 100 μl dung dịch Protein Precipitation (có thể thấy kết tủa protein) rồi vortex mạnh trong 10–20 giây. Ly tâm ở 13.000–16.000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng (xuất hiện kết tủa màu nâu ở đáy ống ), cho 300 μl isopropanol ở nhiệt độ phịng vào ớng 1,5 ml vơ trùng mới. Chuyển dung dịch nổi sau khi ly tâm vào ống chứa isopropanol (chú ý không hút hết dung dịch và để đầu pipet chạm vào kết tủa protein tránh nhiễm ADN với kết tủa). Trộn nhẹ nhàng dung dịch bằng cách đảo đầu cho tới khi có thể nhìn thấy vẩn tủa là các sợi ADN màu trắng. Ly tâm ở 13.000–16.000 vịng/phút (có thể thấy hạt ADN vẩn tủa màu trắng). Gạn bỏ dung dịch nổi, thấm dung dịch trên thành ống sau khi gạn. Thêm 300 μl cồn 70% ethanol ở nhiệt độ phịng, đảo nhẹ ớng vài lần để rửa kết tủa ADN. Ly tâm 14.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng rồi hút cẩn thận dung dịch ethanol bằng pipet. Đảo ống đặt trên giấy thấm và làm khơ hạt tủa ở nhiệt độ phịng. Thêm 100 μl dung dịch ADN Rehydration Soulution vào ống. Để dung dịch qua đêm ở 40C (hoặc ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng; hoặc ủ dung dịch ở 65C trong 1 giờ, phải trộn dung dịch bằng cách búng nhẹ vào ống). Cuối cùng, bảo quản ADN ở -20C.

2.2.3. Phương pháp đo nồng độ quang học

Xác định nồng độ ADN

Nồng độ và độ sạch của ADN tổng số được xác định bằng cách đo độ

hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Nồng độ ADN được tính theo cơng thức:

[ADN] = A260 x n x 50 (g/ml) Trong đó: A260 : độ hấp thụ của ADN ở bước sóng 260 nm

n : sớ lần pha lỗng mẫu

50 : nồng độ ADN tương ứng khi A260 = 1

2.2.4. Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng hầu hết trong các phịng thí nghiệm sinh học phân tử. Nguyên tắc chính của kỹ thuật này là sử dụng enzym ADN polymerase chịu nhiệt để nhân đoạn ADN với cặp mồi đặc hiệu ở đầu 3’ của ADN sợi khuôn. Chu kỳ phản ứng PCR có 3 giai đoạn chính: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn mồi, giai đoạn kéo dài mạch ADN.  

Trình tự mồi được sử dụng cho PCR các đoạn gen CYP19A1 mang các vị trí SNP trong nghiên cứu này được tham khảo từ nghiên cứu của L.Yang và cs năm 2015 [70], được trình bày ở Bảng 5.

Bảng 5: Trình tự mồi cho phản ứng PCR

Mồi Trình tự

Mồi xi F 5'-CTGGAACACTAGAGAAGGCTGGTCAGTGC-3' Mồi ngược R 5'-GTTCTCTGGTGTGAACAGGAGATGAC-3'

Sản phẩm PCR là một đoạn ADN kích thước 202 bp được khuếch đại. Điều kiện tới ưu cho phản ứng PCR được trình bày ở Bảng 6

Bảng 6: Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR

Thành phần Thể tích (l) Điều kiện PCR ADN 1 Chu trình nhiệt: 94oC–2 phút; 35 chu kỳ [94oC–30 giây; 59oC–40 giây; 72oC–40 giây]; 72oC–5 phút, giữ nhiệt ở 20oC. DNTPs (2 nM) 2,5 Đệm 10X(20 mM Mg2+) 2,5 Mồi F 1 Mồi R 1

Taq ADN Polymerase (5 u) 0,2

DDW 16,8

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%, đệm TAE 1X trong 30 phút ở 90V, nhuộm với Ethidium Bromide và chụp hình để kiểm tra kết quả.

2.2.5. Kỹ thuật PCR–RFLP

Sản phẩm của phản ứng PCR có chứa SNP rs10046 được ủ với enzyme cắt giới hạn FastDigestSduI. Thành phần và điều kiện tối ưu cho phản ứng cắt được trình bày ở Bảng 7.

Bảng 7: Thành phần và điều kiện phản ứng cắt với enzyme giới hạn Thành phần Thể tích (l)

ADN (sản phẩm PCR) 15

10 fast digest buffer 2

Fast digest enzyme 1

DDW 12

Tổng 30

Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 15 phút

Sản phẩm PCR cắt hồn tồn hoặc khơng cắt với enzyme SduI được điện di trên gel agarose 2% đệm TAE 1X trong 50 phút ở 70V, nhuộm với Ethidium Bromide và chụp hình để kiểm tra kết quả.

Trong nghiên cứu này, SNP rs10046 của gen CYP19A1 được phân biệt dựa vào

các băng đặc trưng được thể hiện trên Hình 10.

2.2.6. Kỹ thuật PCR–CTPP

Trrình tự 2 cặp mồi đối nhau sử dụng trong phản ứng PCR–CTPP ở nghiên cứu này, được tham khảo từ nghiên cứu của Kaoru Hirose và cs (2004) [29], trình bày ở Bảng 8

Bảng 8: Trình tự 2 cặp mồi trong phản ứng PCR–CTPP

Xác định alen C F1 5’-ATCTGTACTGTACAGCACC-3’ R1 5’-ATGTGCCCTCATAATTCCG-3’ Xác định alen T F2 5’-GGCCTTTTTCTCTTGGTGT-3’

R2 5’-CTCCAAGTCCTCATTTGCT-3’ Điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR–CTPP được trình bày ở Bảng 9.

Bảng 9: Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR–CTPP Thành phần Thể tích (l) Điều kiện PCR ADN 1 Chu trình nhiệt: 95oC–10 phút; 30 chu kỳ [95oC–1 phút; 54oC– 1 phút; 72oC–1 phút]; 72oC–5 phút, giữ nhiệt ở 20oC. DNTPs (2 nM) 2,5 Đệm 10X(20 mM Mg2+) 2,5 Mồi F1 1 Mồi R1 1 Mồi F2 1 Mồi R2 1 AmpliTaq Gold (5 u) 0,2 DDW 14,8 Tổng 25

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2% đệm TAE 1X trong 30 phút ở 70V, nhuộm với Ethidium Bromide và chụp hình để kiểm tra kết quả. Trong nghiên cứu này, SNP rs2236722 của gen CYP19A1 được phân biệt dựa vào các

băng đặc trưng được thể hiện trên Hình 11. Băng 200 bp đặc trưng cho alen T, băng 264 bp đặc trưng cho alen C, và một băng chung có kích thước 427 bp.

Hình 11. Kiểu gen tại vị trí SNP rs2236722 của gen CYP19A1 2.2.7. Phương pháp điện di

Điện di gel agarose là một phương pháp rất phổ biến và quan trọng để phân tích các phân tử sinh học. Khi có điện trường chạy qua bản gel, phân tử ADN mang nhóm phosphate tích điện âm di chuyển từ cực âm sang cực dương trong điện trường. Tốc độ di chuyển của ADN phụ thuộc vào: kích thước ADN, nồng độ agarose, điện áp sử dụng, ethidium bromide, và dung dịch đệm điện di. Các bước thực hiện:

Đặt lược sẵn ở 1 đầu khuôn, đặt khuôn ở nơi bằng phẳng, dùng miếng bọt khí để kiểm tra. Khi đở gel agarose 1%, cân 1g agarose cho vào bình tam giác 250ml, thêm 100 ml dung dịch TAE 1X. Đổ gel agarose 2%, cân 2g agarose cho vào bình tam giác 250 ml, thêm 100 ml dung dịch TAE 1X. Sau đó lắc nhẹ cho agarose hịa lẫn dung dịch đệm. Đặt bình tam giác vào lị vi sóng đun khoảng 1-2 phút. Khi dung dịch sơi lên và có màu trắng trong, lấy bình tam giác ra, đợi 15 phút thấy vừa nóng (60oC) thì đở nhẹ dung dịch vào khn điện di. Khoảng 45 phút thì agarose đặc lại, gel đởi thành màu trắng đục. Sau đó, lấy

nhẹ lược ra, thêm dung dịch đệm điện di phủ mặt gel khoảng 3–5mm. Trước khi load mẫu vào giếng gel điện di, cần trộn đều mẫu với dung dịch dye theo tỉ lệ 1dye : 6 mẫu, sau đó dùng micropipette nhỏ mẫu vào lần lượt các giếng. Khởi động nguồn điện, chọn điện thế và thời gian, xong nhấn nút Run. Nhuộm gel với Ethidium Bromide và xem gel dưới đèn UV và chụp ảnh.

Trong nghiên cứu này, ADN tổng số được điện di trên gel agarose 1%. Ngoài ra, sản phẩm phản ứng PCR và phản ứng cắt với enzyme SduI được điện di trên gel agarose 2%. Đệm điện di là TAE 1X với thành phần chứa trong 100ml như sau: 1,08 g Tris–base, 0,55 g acid ric, 400 μl EDTA 0,5 M pH 8.

2.2.8. Giải trình tự

Các đoạn trình tự dài 202 bp, 427bp của gen CYP19A1 chứa lần lượt SNP rs10046, SNP rs2236722 được gửi giải trình tự tại hãng 1st BASE DNA Sequencing (Malaysia)

2.2.9. Phương pháp phân tích thống kê

Phần mềm Stata 12 được sử dụng để phân tích thớng kê và xử lý sớ liệu. Tần số của các alen được kiểm tra phân bố theo định luật cân bằng Hardy – Weinberg bằng kiểm định Chi–square test.

Mối liên hệ giữa các SNP trên gen CYP19 và nguy cơ mắc ung thư vú được thể hiện bằng giá trị OR (Odds Ratio). Odds là xác suất mắc bệnh chia cho xác suất không mắc bệnh. Nếu p là xác suất mắc bệnh, thì 1 – p là xác suất khơng mắc bệnh. Theo đó, odds được định nghĩa bằng:

Odds = p 1− p

Odds > 1: Khả năng mắc bệnh cao hơn khả năng không mắc bệnh Odds = 1: Khả năng mắc bệnh bằng với khả năng không mắc bệnh Odds < 1: Khả năng mắc bệnh thấp hơn khả năng khơng mắc bệnh Odd mắc bệnh trong nhóm có ́u tớ nguy cơ là: Odd1 = p1

1− p1

Odd mắc bệnh trong nhóm khơng có ́u tớ nguy cơ là: Odd2 = p2 1− p2 OR được định nghĩa là tỉ số của hai odds:

OR = Odd1

Odd2 = p1/(1− p1) p2/(1− p2)

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết ADN tổng số 3.1. Tách chiết ADN tổng số

ADN của cả nhóm mắc bệnh và nhóm đới chứng được tách chiết theo quy trình đã trình bày ở mục 2.2.2. Chất lượng ADN tởng sớ được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được trình bày trên Hình 12. Kết quả điện di cho thấy ADN tách chiết cho băng đậm nét và khơng có vệt băng phụ.

Hình 12. Kết quả điện di ADN tổng số của đại diện một số mẫu nghiên cứu

(gel agarose 1%; M: Marker Lamda HindIII)

Từ kết quả điện di ADN tổng số, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ ADN bằng phương pháp đo quang phổ.

Kết quả cho thấy các mẫu ADN tách chiết đều cho nồng độ tốt, tỷ lệ A260/A280 trong khoảng 1.8 – 2.0 chứng tỏ ADN có độ sạch cao, đạt yêu cầu để sử dụng trong các phản ứng PCR tiếp theo. Kết quả đo OD của đại diện một sớ mẫu nghiên cứu được trình bày trong Bảng 10.

Bảng 10: Kết quả OD của đại diện một số mẫu ADN tách chiết Mẫu A260/A280 Nồng độ ADN (ng/l)

8B 1,89 62,00 14B 1,86 86,10 21B 1,87 86,50 18C 1,92 61,80 22C 1,91 66,38 37C 1,94 50,38

3.2. Kết quả PCR nhân bản đoạn gen CYP19A1

Kết quả phản ứng PCR của đại diện một sớ mẫu nghiên cứu được thể hiện ở Hình 13 (A và B) ở cả nhóm bệnh và nhóm đới chứng.

(A)

(B)

Hình 13. Sản phẩm PCR của đại diện một số mẫu nghiên cứu (gel agarose

2%, M: marker 100 bp, (-): đối chứng âm)

(A) Kết quả PCR của nhóm bệnh (B) Kết quả PCR của nhóm đới chứng

Đoạn ADN được kh́ch đại có kích thước 202bp, kết quả điện di cho băng rõ nét và duy nhất, chứng tỏ phản ứng nhân bản đoạn ADN là đặc hiệu ở cả các mẫu nhóm bệnh và nhóm chứng.

3.3. Kết quả PCR–RFLP để xác định kiểu gen tại SNP rs10046

Sản phẩm của phản ứng PCR, đoạn ADN được khuếch đại với kích thước 202 bp, được ủ với enzyme cắt giới hạn SduI. Kết quả của phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn được điện di trên gel agarose 2%và thể hiện trên Hình 14 (A và B).

(A)

(B)

Hình 14. Kết quả phản ứng cắt với enzyme giới hạn của đại diện một số mẫu

nghiên cứu (gel agarose 2%, M: marker 100 bp, (-): đới chứng âm)

(A) Kết quả PCR–RFLP của nhóm bệnh. (B) Kết quả PCR–RFLP của nhóm đới chứng.

Kiểu gen đồng hợp tử CC được xác định bằng sự xuất hiện của 2 băng 172 bp và 30 bp. Kiểu gen đồng hợp tử TT được xác định bằng đoạn 202 bp. Kiểu gen dị hợp tử CT được xác định bằng 3 đoạn băng với kích thước 202 bp,

172 bp và 30 bp. Do đoạn băng có kích thước 30 bp là quá nhỏ nên không thể quan sát được trên bản gel điện di ở Hình 14. Tuy nhiên, vì ở các đường chạy có cả 2 băng 202 bp và 172 bp, chứng tỏ đây là các mẫu có kiểu gen TC.

(A)

(B)

(C)

Hình 15. Kết quả giải trình tự đoạn gen CYP19A1 dài 202 bp có vị trí SNP

rs10046 của đại diện một số mẫu nghiên cứu (dấu “” chỉ SNP rs 10046).

(A) Kiểu gen CC của mẫu 38B; (B) Kiểu gen TT của mẫu 9C; (C) Kiểu gen CT của mẫu 8C.

Chúng tôi chọn 3 mẫu đại diện cho 3 nhóm kiểu gen gồm 38B (kiểu gen CC), 9C (kiểu gen TT) và 8C (kiểu gen CT) để giải trình tự bằng kỹ thuật giải trình tự ADN tự động nhằm khẳng định tính chính xác của các kiểu gen được xác định ở các mẫu này. Đoạn gen nghiên cứu ở 3 mẫu được khuếch đại

bằng cặp mồi F – R, sau đó tinh sạch sản phẩm PCR và gửi giải trình tự. Kết quả giải trình tự như trong Hình 15. Tiến hành phân tích trình tự, so sánh với trình tự gớc trên Genbank (NC_000015.10:g.51210789G>A), chúng tơi nhận thấy kết quả giải trình tự là hồn tồn trùng khớp với kết quả xác định kiểu gen của từng mẫu dựa vào kỹ thuật PCR–RFLP.

3.4. Kết quả PCR–CTPP để xác định kiểu gentại SNP rs2236722

Kết quả phản ứng PCR–CTPP của đại diện một sớ mẫu nghiên cứu được thể hiện trên Hình 16 (A và B).

(A)

(B)

Hình 16. Kết quả phản ứng PCR–CTPP của đại diện một số mẫu nghiên cứu

(gel agarose 2%, M: marker 100 bp, (-): đối chứng âm)

(A) Kết quả phản ứng PCR–CTPP của nhóm bệnh (B) Kết quả phản ứng PCR–CTPP của nhóm đới chứng

Kiểu gen đồng hợp tử TT được xác định bằng sự xuất hiện của 2 băng 427 bp và 200 bp. Kiểu gen dị hợp tử TC được xác định bằng 3 đoạn băng với kích thước 427 bp, 264 bp và 200 bp.

Chúng tôi chọn 2 mẫu gồm 7B (kiểu gen TC) và 1C (kiểu gen TT) để khuếch đại đoạn 427 bp gen CYP19A1 bằng cặp mồi F1 – R2, sau đó tinh sạch sản phẩm và gửi giải trình tự. Kết quả giải trình tự như trong Hình 17.

(A)

(B)

Hình 17. Kết quả giải trình tự đoạn gen CYP19A1 dài 427 bp có vị trí SNP

rs2236722 của đại diện một số mẫu nghiên cứu (dấu “” chỉ SNP rs 2236722).

(A) Kiểu gen TC của mẫu 7B. (B) Kiểu gen TT của mẫu 1C.

Tiến hành phân tích trình tự, so sánh với trình tự gớc trên Genbank (NC_000015.10:g.51242798A>G), chúng tơi nhận thấy kết quả giải trình tự là hồn tồn trùng khớp với kiểu gen của từng mẫu.

3.5. Kết quả phân tích thống kê

3.5.1. Phân tích ảnh hưởng của SNP rs10046 trên gen CYP19A1 đối với nguy cơ mắc ung thư vú

Kết quả tỷ lệ kiểu gen và tần số alen của gen CYP19A1 tại SNP rs10046 trong nhóm bệnh và nhóm đới chứng được trình bày trong Bảng 11. Tỷ lệ kiểu gen CC, CT, TT trong nhóm bệnh lần lượt là 18.33%, 58.33%, 23.34%; trong đó tỷ lệ này ở nhóm bình thường lần lượt là 14%, 48% và 38%. Tỷ lệ kiểu gen CC và CT ở nhóm bệnh ung thư vú (76.66%) cao hơn 14.66% so với nhóm đới chứng (62%). Tần sớ alen C ở nhóm bệnh (47.5%) lớn hơn 9.5% so với tỷ lệ đó ở nhóm đới chứng (38%).

Bảng 11: Phân bố kiểu gen và tần số alen của gen CYP19A1 tại SNP rs10046

Tần số kiểu gen Tần số alen

CC CT TT C T Nhóm bệnh 11 (18,33%) 35 (58,33%) 14 (23,34%) 57 (47,50%) 63 (52,50%) Nhóm đối chứng 7 (14,00%) 24 (48,00%) 19 (38,00%) 38 (38,00%) 62 (62.00%) Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen tại SNP rs10046 phù hợp với cân bằng Hardy – Weinberg (HW) ở từng nhóm bệnh (p>0.05) và nhóm đới chứng (p>0.05), được trình bày ở Bảng 12.

Bảng 12: Sự phù hợp của các số liệu quan sát tại SNP rs10046 với cân bằng

HW trong nhóm bệnh và nhóm đới chứng

Kiểu gen Tần số thực tế Tần số lý thuyết

Nhóm bệnh CC 11 13,5735 𝜒2 = 1,73 p > 0.05 CT 35 29,925 TT 14 16,5375 Nhóm đới chứng CC 7 7,22 𝜒2 = 0,017 p > 0.05

Ứng dụng và triển vọng của SNP

Gen CYP19A1 và ung thư vú