CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Kết quả PCR–RFLP để xác định kiểu gentại SNP rs10046
Sản phẩm của phản ứng PCR, đoạn ADN được khuếch đại với kích thước 202 bp, được ủ với enzyme cắt giới hạn SduI. Kết quả của phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn được điện di trên gel agarose 2%và thể hiện trên Hình 14 (A và B).
(A)
(B)
Hình 14. Kết quả phản ứng cắt với enzyme giới hạn của đại diện một số mẫu
nghiên cứu (gel agarose 2%, M: marker 100 bp, (-): đối chứng âm)
(A) Kết quả PCR–RFLP của nhóm bệnh. (B) Kết quả PCR–RFLP của nhóm đới chứng.
Kiểu gen đồng hợp tử CC được xác định bằng sự xuất hiện của 2 băng 172 bp và 30 bp. Kiểu gen đồng hợp tử TT được xác định bằng đoạn 202 bp. Kiểu gen dị hợp tử CT được xác định bằng 3 đoạn băng với kích thước 202 bp,
172 bp và 30 bp. Do đoạn băng có kích thước 30 bp là quá nhỏ nên không thể quan sát được trên bản gel điện di ở Hình 14. Tuy nhiên, vì ở các đường chạy có cả 2 băng 202 bp và 172 bp, chứng tỏ đây là các mẫu có kiểu gen TC.
(A)
(B)
(C)
Hình 15. Kết quả giải trình tự đoạn gen CYP19A1 dài 202 bp có vị trí SNP
rs10046 của đại diện một sớ mẫu nghiên cứu (dấu “” chỉ SNP rs 10046).
(A) Kiểu gen CC của mẫu 38B; (B) Kiểu gen TT của mẫu 9C; (C) Kiểu gen CT của mẫu 8C.
Chúng tơi chọn 3 mẫu đại diện cho 3 nhóm kiểu gen gồm 38B (kiểu gen CC), 9C (kiểu gen TT) và 8C (kiểu gen CT) để giải trình tự bằng kỹ thuật giải trình tự ADN tự động nhằm khẳng định tính chính xác của các kiểu gen được xác định ở các mẫu này. Đoạn gen nghiên cứu ở 3 mẫu được khuếch đại
bằng cặp mồi F – R, sau đó tinh sạch sản phẩm PCR và gửi giải trình tự. Kết quả giải trình tự như trong Hình 15. Tiến hành phân tích trình tự, so sánh với trình tự gớc trên Genbank (NC_000015.10:g.51210789G>A), chúng tơi nhận thấy kết quả giải trình tự là hồn tồn trùng khớp với kết quả xác định kiểu gen của từng mẫu dựa vào kỹ thuật PCR–RFLP.