Kết quả PCR–CTPP để xác định kiểu gentại SNP rs223- 123docz.net

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.4. Kết quả PCR–CTPP để xác định kiểu gentại SNP rs223672

Kết quả phản ứng PCR–CTPP của đại diện một số mẫu nghiên cứu được thể hiện trên Hình 16 (A và B).

(A)

(B)

Hình 16. Kết quả phản ứng PCR–CTPP của đại diện một số mẫu nghiên cứu

(gel agarose 2%, M: marker 100 bp, (-): đối chứng âm)

(A) Kết quả phản ứng PCR–CTPP của nhóm bệnh (B) Kết quả phản ứng PCR–CTPP của nhóm đới chứng

Kiểu gen đồng hợp tử TT được xác định bằng sự xuất hiện của 2 băng 427 bp và 200 bp. Kiểu gen dị hợp tử TC được xác định bằng 3 đoạn băng với kích thước 427 bp, 264 bp và 200 bp.

Chúng tôi chọn 2 mẫu gồm 7B (kiểu gen TC) và 1C (kiểu gen TT) để khuếch đại đoạn 427 bp gen CYP19A1 bằng cặp mồi F1 – R2, sau đó tinh sạch sản phẩm và gửi giải trình tự. Kết quả giải trình tự như trong Hình 17.

(A)

(B)

Hình 17. Kết quả giải trình tự đoạn gen CYP19A1 dài 427 bp có vị trí SNP

rs2236722 của đại diện một sớ mẫu nghiên cứu (dấu “” chỉ SNP rs 2236722).

(A) Kiểu gen TC của mẫu 7B. (B) Kiểu gen TT của mẫu 1C.

Tiến hành phân tích trình tự, so sánh với trình tự gớc trên Genbank (NC_000015.10:g.51242798A>G), chúng tơi nhận thấy kết quả giải trình tự là hồn tồn trùng khớp với kiểu gen của từng mẫu.

3.5. Kết quả phân tích thống kê

3.5.1. Phân tích ảnh hưởng của SNP rs10046 trên gen CYP19A1 đối với nguy cơ mắc ung thư vú

Kết quả tỷ lệ kiểu gen và tần số alen của gen CYP19A1 tại SNP rs10046 trong nhóm bệnh và nhóm đới chứng được trình bày trong Bảng 11. Tỷ lệ kiểu gen CC, CT, TT trong nhóm bệnh lần lượt là 18.33%, 58.33%, 23.34%; trong đó tỷ lệ này ở nhóm bình thường lần lượt là 14%, 48% và 38%. Tỷ lệ kiểu gen CC và CT ở nhóm bệnh ung thư vú (76.66%) cao hơn 14.66% so với nhóm đới chứng (62%). Tần sớ alen C ở nhóm bệnh (47.5%) lớn hơn 9.5% so với tỷ lệ đó ở nhóm đới chứng (38%).

Bảng 11: Phân bố kiểu gen và tần số alen của gen CYP19A1 tại SNP rs10046

Tần số kiểu gen Tần số alen

CC CT TT C T Nhóm bệnh 11 (18,33%) 35 (58,33%) 14 (23,34%) 57 (47,50%) 63 (52,50%) Nhóm đối chứng 7 (14,00%) 24 (48,00%) 19 (38,00%) 38 (38,00%) 62 (62.00%) Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen tại SNP rs10046 phù hợp với cân bằng Hardy – Weinberg (HW) ở từng nhóm bệnh (p>0.05) và nhóm đới chứng (p>0.05), được trình bày ở Bảng 12.

Bảng 12: Sự phù hợp của các số liệu quan sát tại SNP rs10046 với cân bằng

HW trong nhóm bệnh và nhóm đới chứng

Kiểu gen Tần số thực tế Tần số lý thuyết

Nhóm bệnh CC 11 13,5735 𝜒2 = 1,73 p > 0.05 CT 35 29,925 TT 14 16,5375 Nhóm đới chứng CC 7 7,22 𝜒2 = 0,017 p > 0.05 CT 24 23,56 TT 19 19,22

Mối liên hệ giữa các alen và kiểu gen tại SNP rs10046 trên gen CYP19A1 với nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam được trình bày ở Bảng 13.

Bảng 13: Mối liên hệ giữa alen, kiểu gen tại SNP rs10046 của gen CYP19A1

với nguy cơ mắc ung thư vú

SNP rs10046 Nhóm bệnh Nhóm đối chứng OR 95% CI Kiểu gen TT 14 19 1,00 CT 35 24 1,98 (0,82–4,77) CC 11 7 2,13 (0,64–7,10) CT+CC 46 31 2,01 (0,87–2,54) Alen T 63 62 1,00 C 57 38 1,48 (0,86–5,17)

Kết quả phân tích cho thấy phụ nữ có alen C tại vị trí SNP rs10046 có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 1.48 lần so với phụ nữ có alen T (OR= 1,48, 95% CI = 0,86–2,54).

Kiểu gen CT và CC được coi là có ảnh hưởng đới với bệnh ung thư vú và được phân tích riêng khi so sánh với kiểu gen TT làm tham chiếu. Phụ nữ mang kiểu gen CC có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 2.13 lần so với phụ nữ có kiểu gen TT (OR= 2,13, 95% CI = 0,64–7,10). Phụ nữ mang kiểu gen CT có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 1.98 lần so với phụ nữ có kiểu gen TT (OR= 1,98, 95% CI = 0.82–4,77). Nhóm người bao gồm kiểu gen CC và CT có nguy cơ mắc bệnh ung thư vú gấp 2,01 lần so với nhóm người có kiểu gen TT (OR= 2,01, 95% CI = 0,87–4,67).

3.5.2. Phân tích ảnh hưởng SNP rs2236722 (Trp339Arg) trên gen

Kết quả tỷ lệ kiểu gen và tần số alen của gen CYP19A1 tại SNP

rs2236722 (Trp39Arg) trong nhóm bệnh và nhóm đới chứng được trình bày trong Bảng 14. Tỷ lệ kiểu gen TT, TC, CC trong nhóm mắc ung thư vú lần lượt là 90%, 10%, 0%; trong đó tỷ lệ này ở nhóm đới chứng lần lượt là 94%, 6% và 0%. Trong nhóm mắc ung thư vú, tỷ lệ alen C là 5% và bằng 1

19 so với tỷ lệ alen T (95%). Tỷ lệ kiểu gen đồng hợp tử CC ở cả 2 nhóm bệnh và đới chứng đều là 0%. Tỷ lệ kiểu gen dị hợp tử CT ở nhóm mắc ung thư vú (10%) cao hơn 4% so với nhóm đới chứng (6%).

Bảng 14: Phân bố kiểu gen và tần số alen của gen CYP19A1 tại SNP rs2236722

Tần số kiểu gen Tần số alen

TT TC CC T C

Nhóm bệnh 54 (90%) 6 (10%) 0 (0%) 114 (95%) 6 (5%)

Nhóm đối chứng 47 (94%) 3 (6%) 0(0%) 97 (97%) 3 (3%)

Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen phù hợp với cân bằng Hardy – Weinberg ở từng nhóm bệnh (p>0.05) và nhóm đới chứng (p>0.05), được trình bày ở Bảng 15.

Bảng 15: Sự phù hợp của các số liệu quan sát tại SNP rs2236722 với cân

bằng HW trong nhóm bệnh và nhóm đới chứng

Kiểu gen Tần số thực tế Tần số lý thuyết

Nhóm bệnh TT 54 54,15 𝜒2 = 0,166 p > 0,05 TC 6 5,7 CC 0 0,15 Nhóm đới chứng TT 47 47,045 𝜒2 = 0,052 p > 0,05 TC 3 2,91 CC 0 0,045

Mối liên hệ giữa các alen và kiểu gen tại SNP rs2236722 trên gen

CYP19A1 với nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam được trình bày ở

Bảng 16.

Bảng 16: Mối liên hệ giữa alen, kiểu gen tại SNP rs2236722 của gen

CYP19A1 với nguy cơ mắc ung thư vú

SNP rs2236722 Nhóm bệnh Nhóm đối chứng OR 95% CI Kiểu gen TT 54 47 1,00 TC+CC 6 3 1,74 (0,40 – 7,42) Alen T 114 97 1,00 C 6 3 1,7 ( 0,31–5,17 )

Kết quả phân tích cho thấy phụ nữ có alen C tại vị trí SNP rs2236722 có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 1.7 lần so với phụ nữ có alen T (OR= 1,7, 95% CI = 0,31–5,17). Kiểu gen TC và CC được coi là có ảnh hưởng đới với ung thư vú khi so sánh với kiểu gen TT làm tham chiếu. Nhóm người mang kiểu gen gồm CC và CT có nguy cơ mắc bệnh ung thư vú gấp 1,74 lần so với nhóm người có kiểu gen TT (OR= 1,74, 95% CI = 0,40–7,42).

3.6. Thảo luận

Estrogen là một ́u tớ đóng vai trị quan trọng trong sự hình thành và phát triển ung thư vú. Các biến đởi di trùn ảnh hưởng đến q trình sinh tởng hợp estrogen, là những yếu tớ nguy cơ liên quan tới sự hình thành và phát triển ung thư vú [52]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự đa hình gen

CYP19A1 có liên quan đến nồng độ estrogen ở phụ nữ [6,19].

SNP rs10046 nằm tại vùng 3’ UTR của gen CYP19A1. Cơ chế ảnh

hưởng của SNP này đối với nguy cơ mắc ung thư vú là không rõ ràng. Nghiên cứu của Farzaneh và cs (2016) ở phụ nữ Iran, thấy rằng có sự khác biệt đáng kể

về tần số allele và tần số kiểu gen tại SNP rs10046 của gen CYP19A1 ở nhóm phụ nữ mắc ung thư vú và nhóm phụ nữ bình thường. Nghiên cứu kết luận rằng, những phụ nữ mang kiểu gen CC hoặc CT có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 2,1 lần so với phụ nữ mang kiểu gen TT tại SNP rs10046 (OR= 2,1, 95% CI = 1,4–4,1) [21]. Các nghiên cứu của Zhang và cs (2015) [70], Chen và cs (2008) [16] ở phụ nữ Trung Quốc, đều cho rằng alen C tại SNP rs10046 của gen

CYP19A1 có mới liên quan với nguy cơ mắc ung thư vú. Yoshimoto và cs

(2011) nghiên cứu SNP rs10046 ở phụ nữ Nhật Bản, cho rằng alen C có thể được coi là yếu tố dự báo nguy cơ ung thư vú (p = 0,007) [71].

Tuy nhiên, nghiên cứu của Kristensen và cs (2000) ở phụ nữ Na Uy, kết luận rằng phụ nữ có alen C tại SNP rs10046 có nguy cơ mắc thư vú giảm so với phụ nữ có alen T [36]. Nghiên cứu của Zins và cs gần đây, cho thấy mặc dù SNP rs10046 không liên quan đến nguy cơ mắc ung thư vú, nhưng kiểu gen TT được cho là một nguyên nhân của tuổi khởi phát ung thư vú, những phụ nữ mang kiểu gen TT có nguy cơ mắc ung thư vú ở t̉i dưới 50 [73]. Các nghiên cứu của Ghisari và cs (2014) ở phụ nữ bản địa (sinh sống tại vùng Bắc cực) [23], Ralp và cs (2007) ở Mĩ [53], Dunning và cs (2004) [19] ở phụ nữ Bồ Đào Nha, đều kết luận SNP rs10046 của gen CYP19A1 khơng có bất cứ ảnh hưởng nào đến nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ. Một nghiên cứu khác của Pineda và cs (2013) ở phụ nữ Tây Ban Nha, ban đầu họ cũng kết luận rằng những phụ nữ mang alen C tại SNP rs 10046 có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 1.29 lần so với phụ nữ mang alen T (OR = 1,29, 95% CI = 1,01–1,66) [52]. Tuy nhiên khi phân tích tởng hợp thì mới liên hệ này biến mất. Họ kết luận rằng SNP rs10046 không ảnh hưởng đến nguy cơ mắc ung thư vú nhưng nó có thể tương tác cùng các biến thể di truyền khác để điều chỉnh nồng độ estrogen và các chỉ sớ hố sinh khác ở phụ nữ.

CYP19A1 có ảnh hưởng đến nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ, trong đó: phụ

nữ mang kiểu gen CC có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 2,13 lần so với phụ nữ có kiểu gen TT (OR= 2,13, 95% CI = 0,64–7,10), phụ nữ mang kiểu gen CT có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 1,98 lần so với phụ nữ có kiểu gen TT (OR= 1,98, 95% CI = 0,82–4,77), nhóm người bao gồm kiểu gen CC và CT có nguy cơ mắc bệnh ung thư vú gấp 2,01 lần so với nhóm người có kiểu gen TT (OR= 2,01, 95% CI = 0,87–4,67). Phụ nữ có alen C tại vị trí SNP rs10046 có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 1,48 lần so với phụ nữ có alen T (OR= 1,48, 95% CI = 0,86–2,54). Tuy nhiên vẫn chưa thấy được mối liên hệ giữa SNP rs10046 và nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam. Những kết luận khác nhau trong các nghiên cứu về SNP có thể là do quần thể, dân tộc nghiên cứu khác nhau.

Đa hình của gen CYP19A1 tại rs 2236722 là một đa hình hiếm gặp. Kiểu gen đồng hợp tử CC chỉ có ở một sớ ít người, như Hawaiian (2,1%) và Nhật Bản (2,9%) [56]. Kiểu gen CC của gen CYP19A1 tại SNP rs2236722 không

được quan sát trong nghiên cứu này.

Nghiên cứu của Kaoru Hirose và cs (2004) về sự phân bố kiểu gen

CYP19A1 tại SNP rs2236722, đã chỉ ra rằng phụ nữ Nhật (trước tuổi mãn kinh)

có kiểu gen CC và TC có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 1.63 lần so với phụ nữ (trước t̉i mãn kinh) có kiểu gen TT (OR= 1,63, 95% CI = 0,77–3,44) [29]. Một nghiên cứu khác của Bora và cs (2010) về SNP rs2236722 trên gen

CYP19A1 ở phụ nữ Thổ Nhĩ Kỳ cũng kết luận, kiểu gen TT dường như là kiểu

gen bảo vệ, người mang alen C làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú [10].

Tuy nhiên, nghiên cứu của Miyoshi và cs (2000), lại kết luận rằng nhóm người có kiểu gen CC và TC có nguy cơ mắc ung thư vú giảm 0.39 lần so với phụ nữ có kiểu gen TT (OR= 0,39, 95% CI = 0,17–0,89) [43].

rs2236722 của gen CYP19A1 có ảnh hưởng đến nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ, trong đó: nhóm phụ nữ có kiểu gen TC và CC tại SNP rs2236722 của gen

CYP19A1 có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 1,74 lần so với phụ nữ mang kiểu gen

TT (OR= 1,74, 95% CI= 0,40–7,42). Phụ nữ có alen C tại vị trí SNP rs2236722 có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp 1,7 lần so với phụ nữ có alen T (OR= 1,7, 95% CI = 0,31–5,17). Tuy nhiên vẫn chưa thấy được mối liên hệ giữa SNP rs2236722 và nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận

Nghiên cứu mối liên hệ giữa SNP rs10046, SNP rs2236722 của gen

CYP19A1 với nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam cho kết quả như sau:

1. Tần số alen C và T tại SNP rs10046 của gen CYP19A1 tương ứng là 38% và 62% ở nhóm đới chứng; tỷ lệ này ở nhóm mắc bệnh tương ứng là 47,50% và 52,50%.

2. Tần số alen T và C tại SNP rs2236722 của gen CYP19A1 tương ứng là 97% và 3% ở nhóm đới chứng; tỷ lệ này ở nhóm mắc bệnh tương ứng là 95% và 5%.

3. Chưa thấy được mối liên quan giữa SNP rs10046, SNP rs2236722 của gen

CYP19A1 và nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam.

Kiến nghị

Dựa trên những kết quả đã đạt được, chúng tôi xin đưa ra một số kiến nghị cho hướng nghiên cứu tiếp theo như sau:

1. Mở rộng nghiên cứu trên phạm vi với số lượng mẫu bệnh phẩm và đối chứng lớn hơn.

2. Tiếp tục nghiên cứu về các đa hình đơn nucleotide trên gen CYP19A1 để xác định mới liên quan giữa các SNP này với các biểu hiện lâm sàng khác.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

1. Bùi Diệu, (2011), “Tình hình mắc ung thư ở phụ nữ Hà Nội giai đoạn 2005 – 2008”, Hội nghị Ung bướu 2011, Tổng quát 1.

2. Đặng Thế Căn, Tạ Văn Tờ, Lê Đình Roanh, Phạm Thị Luyền, (2000), “Nghiên cứu thụ thể estrogen và progesteron trong ung thư biểu mô tuyến vú bằng nhuộm hóa mơ miễn dịch”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 5,

tr.22–26.

3. Ngơ Thu Thoa, Ngũn Hồng Như Nga. (2007), “Chẩn đoán tế bào học ở Bệnh viện K”, Y Học TP. Hồ Chí Minh, 11, tr.28–30.

TIẾNG ANH

4. Ali A. B., (2009), “Genetic and epigenetic alteration in the BRCA1 gene in Singapore breast and/or ovarian cancer: A popular based study”, A thesis submitted for the degree of doctor of philosophy department of surgegy Yong Loo Lin School of Medicine National University of Singapore, pp.40–41.

5. Artigalás O., Vanni T., Hu M. H., Ashton-Prolla P., Schwar I. V., (2015), “Influence of CYP19A1 polymorphisms on the treatment of breast cancer with aromatase inhibitors: A systematic review and meta-analysis”, BMC Medicine, 13, pp.139.

6. Baghaei F., Rosmond R., Westberg L., Hellstrand M., Eriksson E., (2003), “The CYP19 gene and associations with androgens and abdominal obesity in premenopausal women”, Obes. Res, 11(4), pp.578–585.

7. Bampali K., Grassos C., Mouzarou A., Liakos C., Mertzanos G., Lamnissou K., and Babalis D., (2015), “Genetic Variant in the CYP19A1 Gene Associated with Coronary Artery Disease”, Genetic Research International, pp.15–20.

8. Bloom H. J., Richarson W. W., (1957), “Histological grading and prognosis in breast carcinoma: a study of 1049 cases of which 359 have been followed for 15 years”, Br J Cancer, 11, pp.359–377.

9. Boone S. D., Baumgartner K. B., Baumgartner R. N., Connor A. E., Pinkston C. M., Rai S. N., (2014), “Associations between CYP19A1 polymorphisms, Native American ancestry, and breast cancer risk and mortality: The Breast Cancer Health Disparities Study”, Cancer Causes &

Control, 25(11), pp.1461–1471.

10. Bora M. T., Tülin Ö., Halil I. K., Sennur I., Calay Z., Oğuz Ö., Turgay I., (2010), “CYP17 (T-34C) and CYP19 (Trp39Arg) Polymorphisms and their Cooperative Effects on Breast Cancer Susceptibility”, in vivo, 24, pp.71–74. 11. Brody J., Moysich K., Humblet O., Attfield K. R., Beehler G. P., Rudel R. A., (2007), “Environmental pollutants and breast cancer: epidemiologic studies”, Cancer, 109, pp.2667–2711.

12. Cai Q., Kataoka N., Li C., Wen W., Smith J. R., Gao Y. T., Xiao O. S., Zheng W., (2008), ”Haplotype analyses of CYP19A1 gene variants and breast cancer risk: Results from the Shanghai Breast Cancer Study”, Cancer

Epidemiol. Biomarkers Prev, 17(1), pp.27–32.

13. Chattopadhyay S., Siddiqui S., Akhtar M. S., Najm M. Z., Deo S. V., Shukla N. K., (2014), “Genetic polymorphisms of ESR1, ESR2, CYP17A1, and CYP19A1 and the risk of breast cancer: A case control study from North India”, Tumour Biology, 35(5), pp.4517–4527.

14. Chen S. A., Besman M. J., Sparkes R. S., Zollman S., Klisak I., Mohandas T., Hall P. F., Shively J. E., (1988), “Human aromatase: cDNA cloning, southern blot analysis, and assignment of the gene to chromosome 15”,

DNA, 7, pp.27–38.

regulation of aromatase expression in human breast tissue”, Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 83, pp.93–99.

16. Chen C., Sakoda L. C., Doherty J. A., Loomis M. M., Fish S., Ray R. M., (2008), “Genetic variation in CYP19A1 and risk of breast cancer and brocystic breast conditions among women in Shanghai, China”, Cancer Epidemiology Biomarkers Prevention, 17(12), pp.3457–3466.

17. Christopher, (2003), “Differences in breast cancer stage, treatment, and

 survival by race and ethnicity”, Arch Intern Med, 20 (163), pp. 49–56.

Kết quả PCR–CTPP để xác định kiểu gentại SNP rs223672

Ứng dụng và triển vọng của SNP

Gen CYP19A1 và ung thư vú