2.4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện tối ƣu
Các điều kiện tối ƣu trên hệ thống phân tích sử dụng cũng nhƣ q trình xử lý mẫu đã đƣợc khảo sát theo phƣơng pháp đơn biến.
Trong phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, pha động ảnh hƣởng tới q trình tách các chất và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, khi có thêm các chất nhƣ acid acetic, acid formic có thể cho thêm vào để tăng độ ion hóa của phân tử, do vậy các chất này đƣợc sử dụng trong pha động. Bên cạnh đó, cột tách sử dụng là cột C30, ít phân cực nên pha động phải là hệ dung môi phân cực nên chúng tôi đã khảo sát 2 hệ dung môi pha độngACN:AcOH 0,1% và MeOH:AcOH0,1%.
Sau khi chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp, chúng tơi khảo sát tốc độ dịng của pha động. Tốc độ pha động ảnh hƣởng đến thời gian rửa giải và lƣợng dung môi tiêu tốn. Nếu tốc độ dịng lớn thì q trình tách các chất trong mẫu sẽ kém hiệu quả, các chất chƣa đủ thời gian để tách ra khỏi nhau mà đã ra khỏi cột phân tích. Nếu tốc độ dịng q nhỏ, thời gian phân tích kéo dài, khơng hiệu quả vê mặt thời gian cho các nhà phân tích. Do vậy chúng tơi tiến hành khảo sát ở tốc độ pha động 0,6 mL/phút; 0,8 mL/phút; 1,0 mL/phút.
2.4.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp
Phƣơng pháp phân tích thể hiện tính đúng đắn trƣớc tiên phải thể hiện độ lặp lại. Trong nghiên cứu chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ƣu. Đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích của cấu tử trong dung dịch khảo sát. Một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn β-sitosterol đã chọn. Mẫu đƣợc bơm vào hệ 3 lần sau đó lấy diện tích pic và tính đƣợc giá trị % RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát.
Sau khi có đầy đủ các điều kiện tối ƣu, tiến hành dựng đƣờng chuẩn β- sitosterol đã khảo sát, thu đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn. Đánh giá sai số hệ
thống qua các hệ số của phƣơng trình hồi quy và kết luận. Sau khi thu đƣợc phƣơng trình hồi quy mới tiến hành phân tích mẫu thực tế.
Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại quá trình xử lý mẫu cũng đƣợc khảo sát và đánh giá. Cùng một mẫu đƣợc cân khối lƣợng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện. Mỗi mẫu sau xử lý đƣợc bơm 3 lần để thu đƣợc hàm lƣợng trung bình. Các giá trị trung bình đó đƣợc sử dụng để đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu. Giá trị % RSD cũng đƣợc dùng làm giá trị đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu.
Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện để đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu. Mẫu thực đƣợc thêm một lƣợng nhất định cácβ-sitosterol chuẩn vào ở 3 mức nồng độ sao cho tổng hàm lƣợng β-sitosterolsau khi xử lý không bị vƣợt quá đƣờng chuẩn. Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và phân tích trên hệ thu đƣợc hàm lƣợng các chất đƣợc thêm vào và đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu.
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN