Từ đƣờng chuẩn thu đƣợc phƣơng trình hồi quy y = (120,71±4,106)x – (3,5161±205,384) với hệ số tƣơng quan R2 = 0,999. Nhƣ vậy, đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic với nồng độ β-sitosterol tƣơng ứng là đạt yêu cầu và đƣợc chấp nhận.
3.3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng
Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xL ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích (yL) khác có ý nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Giới hạn phát hiện:
Sb là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng
k là đại lƣợng số học đƣợc chọn theo độ tin cậy mong muốn.
Trong trƣờng hợp khơng phân tích mẫu trắng thì có thể xem độ lệch chuẩn của mẫu trắng Sb đúng bằng sai số của phƣơng trình hồi quy, tức là Sb = Sy và tín hiệu phân tích mẫu nền yb= a. Khi đó, tín hiệu thu đƣợc ứng với nồng độ phát hiện YLOD= a + k.Sy. Với độ tin cậy 95%, k=3. Sau đó dung phƣơng trình hồi quy có thể tìm đƣợc LOD. y = 120.7x - 3.516 R² = 0.999 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 20 40 60 80 100 120
xLOD= Giới hạn định lƣợng (LOQ)
LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Cơng thức tính giới hạn định lƣợng: LOQ= 3,33 LOD.
Từ sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ, ta tính đƣợc LOD, LOQ của β-sitosterol nhƣ trong bảng 3.5:
Bảng 3. 5. Bảng kết quả LOD, LOQ của β-sitosterol Chất Sy (độ lệch chuẩn của Chất Sy (độ lệch chuẩn của
phƣơng trình hồi quy)
b (độ dốc của phƣơng trình hồi quy) LOD (ppm) LOQ (ppm) β- sitosterol 1,489 120,71 0,037 0,123
3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
3.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp xử lý mẫu
Độ lặp lại của q trình xử lí mẫu đƣợc thực hiện bằng cách cân cùng 1 khối lƣợng mẫu lô hội. Mẫu đƣợc cân và chuyển vào 3 bình, tiến hành quy trình xử lý mẫu đã đƣa ra ởhình 3.12, các điều kiện chạy HPLC nhƣ đã khảo sát ở mục 3.1.4. Kết quả độ lặp lại đƣợc thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3. 6. Độ lặp lại quy trình phân tích β-sitosteroltrong mẫu lơ hội thơ Lần 1(mg/g) m=105,0102g Lần 2 (mg/g) m= 104,2078g Lần 3 (mg/g) m= 103,1087 Trung bình (mg/g) %RSD 11,877 11,829 12,155 11,954 1,47
Từ bảng nhận thấy, % RSD giữa hàm lƣợng β-sitosterol trong các lần xử lý mẫu khá tốt, đều nhỏ hơn 5%, từ đó cho thấy q trình xử lý mẫu có độ lặp lại tin cậy đƣợc.
3.4.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp
Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu là một trong những đại lƣợng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp. Nó cho biết lƣợng chất bị mất đi trong quá trình xử lý mẫu. Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp xử lý mẫu đã chọn.
Để đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp, chúng tôi đã lựa chọn một loại mẫu không phát hiện β-sitosterol, chúng tôi lựa chọn mẫu trà thảo dƣợc, thêm
chuẩn vào mẫu đó và xử lý theo quy trình đƣa ra ở hình 3.12, các điều kiện chạy HPLC đã khảo sát ở mục 3.1.4 và tiến hành phân tích hàm lƣợng β-sitosterol.
Mẫu đƣợc cân khối lƣợng khoảng 0,2-0,3g trên cân phân tích, chuyển vào bình 15ml. Nồng độ đƣợc thêm vào tính theo sau khi định mức.
Bình 0: mẫu trắng, chỉ chứa 10 ml acetonitril. Bình 1 và 2: chỉ chứa lƣợng mẫu đã cân.
Bình 3 và 4: mẫu đƣợc thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 5 ppm. Bình 5 và 6: mẫu đƣợc thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 10 ppm. Bình 7 và 8: mẫu đƣợc thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 20 ppm. Tất cả các bình sau đó đƣợc thêm ACN đến 10 ml.
Các mẫu đƣợc xử lý cùng nhau, và tiến hành bơm vào cột sắc ký. Các sắc đồ đƣợc thể hiện trên các hình 3.16, 3.17, 3.18.