3.1.1. Khảo sát thành phần pha động
Thành phần pha động ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Pha động có thể ảnh hƣởng tới những vấn đề sau của sự tách sắc ký của các chất:
Độ chọn lọc của hệ pha
Thời gian lƣu giữ của chất tan
Hiệu lực cột tách (đại lƣợng Nef)
Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh.
Độ rộng của pic sắc ký.
Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng tách có độ phân cực nhỏ và trung bình có trộn với một số dung môi hữu cơ để thu đƣợc dung dịch có độ phân cực từ thấp tới cao, phù hợp với quá trình tách.
Các chất phân tích là các chất ít phân cực, pha tĩnh đƣợc chọn là cột pha đảo C30, kém phân cực , vì vậy pha động dùng để tách phải là hệ dung mơi phân cực, thì mới có thể tách β-sitosterol.
Chúng tôi đã nghiên cứu, thử nghiệm các hệ dung môi sau:
Hệ dung môi 1: MeOH- AcOH 0,1%
Hệ dung môi 2: ACN – AcOH 0,1% Cố định các điều kiện sắc ký:
Cột C30 (5μm; 4,6 x 250mm) Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
Tiến hành phân tích mẫu β-sitosterol chuẩn với khoảng nồng độ từ 5 – 100ppm, và khảo sát theo hai hệ dung môi nhƣ trên. Sắc đồ định lƣợng β-sitosterol với 2 hệ dung mơi khác nhau đƣợc thể hiện ở hình 3.1 và hình 3.2.
Hình 3.1. Sắc đồ HPLC khi sử dụng hệ dung mơi ACN/AcOH 0,1%
Hình 3.2. Sắc đồ HPLC khi sử dụng hệ dung môi MeOH/AcOH 0,1%
Từ 2 sắc đồ trên chúng tôi nhận thấy, khi phân tích β-sitosterol với 2 hệ dung mơi pha động đều xuất hiện duy nhất một pic của β-sitosterol, tuy nhiên với hệ
dung mơi ACN/AcOH 0,1% cho hình dạng pic cân xứng hơn và thời gian lƣu có thấp hơn với hệ dung mơi MeOH/AcOH 0,1%. Vì vậy chúng tơi lựa chọn hệ pha động là ACN/AcOH 0,1% cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.2. Khảo sát tốc độ dòng của pha động
Để khảo sát tốc độ pha động, chúng tôi tiến hành phân tích β-sitosterol
chuẩn và cố định các điều kiện sắc kí: Cột C30 (5μm; 4,6 x 250mm)
Dung mơi pha động ACN:AcOH 0,1%
Mẫu phân tích: chất chuẩn β-sitosterol với nồng độ: 5-100 ppm
Và thay đổi tốc độ của pha động 0,6 mL/phút; 0,8 mL/phút; 1,0 mL/phút, chúng tơi thu đƣợc kết quả sau:
Hình 3.3.Sắc đồ HPLC tại tốc độ dịng 0,6 ml/phút, hệ dung mơi ACN/AcOH 0,1%
Hình 3.4. Sắc đồ HPLC tại tốc độ dịng 0,8 ml/phút, hệ dung mơi ACN/AcOH 0,1%
Hình 3.5. Sắc đồ HPLC tại tốc độ dịng 1 ml/phút, hệ dung mơi ACN/AcOH 0,1% Từ sắc đồ chúng tơi nhận thấy: khităng tốc độ dịng của pha động, các pic sắc ký có xu hƣớng nhọn và rõ nét nhƣng diện tích pic lại giảm. Tại tốc độ dịng 0,6 mL/phút diện tích pic của các chất lớn nhất nhƣng các pic bị kéo chân về phía sau. Do đó, chúng tơi quyết định lựa chọn tốc độ dịng 0,8 mL/phút. Tại tốc độ này, β- sitosterol bắt đầu đƣợc rửa giải từ 5,8 phút
3.1.3. Khảo sát độ lặp lại của thiết bị
Sự ổn định và lặp lại của hệ thống HPLC cho thấy hệ thống có độ nhạy cao. Độ lặp lại tốt mới cho độ chính xác tốt trong một phạm vi cho phép. Với hệ thống sắc kí, sau khi đã lựa chọn đƣợc các điều kiện tối ƣu cho quá trình tách, thì yếu tố quyết định kết quả phân tích là độ lặp lại của thiết bị, bao gồm độ lặp lại diện tích pic và thời gian lƣu. Dung dịchβ-sitosterol chuẩn để khảo sát độ lặp lại có nồng độ 5ppm, tiến hành chạy hệ thống HPLC với các điều kiện cột tách C30, dung môi pha động ACN:CH3COOH 0,1%, detector PDA (max = 210nm), tốc độ dịng 0,8mL/phút và thể tích mẫu bơm 5l. Dung dịch đƣợc tiến hành bơm 3 lần vào cột để xác định độ lặp lại diên tích pic và thời gian lƣu. Sắc đồ khảo sát độ lặp lại của thiết bị đƣợc thể hiện ở hình 3.6, 3.7, 3.8.
Hình 3. 6. Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 1
Hình 3. 7.Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 2
Từ sắc đồ, chúng tơi đánh giá độ lặp lại của diện tích pic và thời gian lƣu qua
bảng 3.1.
Bảng 3. 1. Độ lặp lại thời gian lƣu và diện tích pic của β-sitosterol
Bơm lần 1 Bơm lần 2 Bơm lần 3 Trung bình %RSD Diện tích pic 627,89 630,34 628,67 628,97 0,20
Thời gian lƣu 5,8467 5,9256 5,8167 5,8630 0,96 Nhận thấy %RSD của diện tích pic trung bình và thời gian lƣu trung bình của các lần lặp lại đều dƣới 5%. Vì vậy, hệ sắc ký đã chọn với các điều kiện tối ƣu nhƣ trên có độ lặp lại tốt, phù hợp với phép phân tích.
3.1.4. Điều kiện tối ƣu cho q trình phân tích β-sitosterol
Phân tích hàm lƣợng β-sitosterol bằng hệ HPLC với các điều kiện tối ƣu đã khảo sát đƣợc:
Cột tách: cột C30 (5μm; 4,6 x 250mm) Dung môi pha động: ACN: AcOH 0,1% Detector:PDA (max = 210nm)
Tốc độ dòng: 0,8mL/phút Thể tích mẫu bơm 5l