3.2.1. Khảo sát cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ các cặn chiết
Áp dụng các phƣơng pháp đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR (1H NMR,
13C NMR với chƣơng trình DEPT) đƣợc ghi trên máy Bruker AM x 500, TMS (tetrametyl silan) (1H NMR) hoặc tín hiệu dung mơi (13C NMR) là chất nội chuẩn, độ dịch chuyển hóa học biểu thị bằng ppm để khảo sát cấu trúc của hợp chất tinh khiết H1 phân lập đƣợc từ cặn chiết n-hexan (EH).
Phổ 1H-NMR, 13 NMR, DEPT của hợp chất H1 đƣợc thể hiện ở hình 3.9
Hình 3. 9. Phổ 1H NMR (CDCl3) của chất H1
Hình 3. 10. Phổ DEPT của chất H1
Trên phổ 1H-NMR của H1xuất hiện các tín hiệu đặc trƣng cho hợp chất sterol có một nối đơi với tín hiệu proton ở vị trí δH 5,34 (br d, J = 5 Hz),một proton methine liên kết với oxy ở vị trí δH 3,52 (1H, m, H-3) và 6 nhóm methyl trong đó có 2 singlet tại δH 0,68 (3H, s) và 1,01 (3H, s), 3tín hiệu doublet tại δ 0,92 (3H, d, J= 6,5 Hz), 0,83 (3H, d, J= 7,3 Hz), 0,80 (3H, d, J= 6,8 Hz), và một tín hiệu triplet tại δ 0,84 (3H, t, J= 7,5 Hz).
Phổ 13C-NMR và DEPT có 29 carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 9 nhóm CH và 3 carbon bậc 4.
Từ tính chất vật lý, số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, tham khảo tài liệu [5], cho ta xác định hợp chất này là 3β-Stigmast-5-en-3-ol. Số liệu phổ đƣợc trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H1 Vị trí Vị trí 1H NMR 1C NMR 1H NMR 1C NMR 3 3.52 (1H,m) 71.8 19 1.01 (3H,s) 19.4 4 2.20-2.31 (2H,m) 42.3 21 0.92 (3H,d) 18.7 6 5.34 (1H,brd) 121.7 26 0.8 (3H,d) 19.0 18 0.68 (3H,s) 11.8 27 0.83 (3H,d) 19.8 29 0.84 (3H,t) 11.9
Hình 3. 11. Cấu trúc của H1: 3β-Stigmast-5-en-3-ol.
Từ đó nhận thấy trong phân đoạn H1, chất phân lập đƣợc là β-sitosterol. Nhƣ vậy dung môi chiết lần 2 chúng tôi lựa chọn là n-hexan để tách β-sitosterol
3.2.2. Khảo sát dung môi chiết mẫu lô hội thô ban đầu
Sau khi phân lập đƣợc β-sitosterol theo mục 3.2.1 chúng tôi tiến hành khảo sát dung môi chiết mẫu lô hội thô ban đầu với 2 loại dung môi là methanol và ethanol theo quy trình phân tích ở hình 3.12.
Sau đó tiến hành phân tích 2 dịch lọc trong 2 loại dung môi theo điều kiện đã khảo sát ở mục 3.1.4 chúng tôi thu đƣợc sắc đồ:
Hình 3. 13.Sắc đồ HPLC của β-sitosterol trong dịch chiết MeOH tại tốc độ dịng 0,8 ml/phút, hệ dung mơi ACN/AcOH 0,1%
Hình 3. 14. Sắc đồ HPLC của β-sitosterol trong dịch chiết EtOH tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1%
Từ sắc đồ trên, diện tích pic khi phân tích β-sitosterol với 2 loại dung mơi
Bảng 3. 3. Diện tích pic phân tích β-sitosteroltrong các hệ dung môi chiết khác nhau
Dung môi Diện tích (mAU.s)
Methanol 1379,38
Ethanol 938,63
Từ sắc đồ và bảng diện tích pic, chúng tơi nhận thấy, hình dạng pic khi phân tích β-sitosterol đƣợc chiết với dung môi MeOH cân xứng hơn, và cho diện tích pic lớn hơn khá nhiều với dung mơi chiết là EtOH. Từ đó chúng tơi lựa chọn dung mơi chiết là MeOH.