Bảng 3. 1. Độ lặp lại thời gian lƣu và diện tích pic của β-sitosterol
Bơm lần 1 Bơm lần 2 Bơm lần 3 Trung bình %RSD Diện tích pic 627,89 630,34 628,67 628,97 0,20
Thời gian lƣu 5,8467 5,9256 5,8167 5,8630 0,96 Nhận thấy %RSD của diện tích pic trung bình và thời gian lƣu trung bình của các lần lặp lại đều dƣới 5%. Vì vậy, hệ sắc ký đã chọn với các điều kiện tối ƣu nhƣ trên có độ lặp lại tốt, phù hợp với phép phân tích.
3.1.4. Điều kiện tối ƣu cho quá trình phân tích β-sitosterol
Phân tích hàm lƣợng β-sitosterol bằng hệ HPLC với các điều kiện tối ƣu đã khảo sát đƣợc:
Cột tách: cột C30 (5μm; 4,6 x 250mm) Dung môi pha động: ACN: AcOH 0,1% Detector:PDA (max = 210nm)
Tốc độ dịng: 0,8mL/phút Thể tích mẫu bơm 5l
3.2. Tối ƣu q trình tách chiết β-sitosterol từ cây Lơ hội
3.2.1. Khảo sát cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ các cặn chiết
Áp dụng các phƣơng pháp đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR (1H NMR,
13C NMR với chƣơng trình DEPT) đƣợc ghi trên máy Bruker AM x 500, TMS (tetrametyl silan) (1H NMR) hoặc tín hiệu dung mơi (13C NMR) là chất nội chuẩn, độ dịch chuyển hóa học biểu thị bằng ppm để khảo sát cấu trúc của hợp chất tinh khiết H1 phân lập đƣợc từ cặn chiết n-hexan (EH).
Phổ 1H-NMR, 13 NMR, DEPT của hợp chất H1 đƣợc thể hiện ở hình 3.9
Hình 3. 9. Phổ 1H NMR (CDCl3) của chất H1
Hình 3. 10. Phổ DEPT của chất H1
Trên phổ 1H-NMR của H1xuất hiện các tín hiệu đặc trƣng cho hợp chất sterol có một nối đơi với tín hiệu proton ở vị trí δH 5,34 (br d, J = 5 Hz),một proton methine liên kết với oxy ở vị trí δH 3,52 (1H, m, H-3) và 6 nhóm methyl trong đó có 2 singlet tại δH 0,68 (3H, s) và 1,01 (3H, s), 3tín hiệu doublet tại δ 0,92 (3H, d, J= 6,5 Hz), 0,83 (3H, d, J= 7,3 Hz), 0,80 (3H, d, J= 6,8 Hz), và một tín hiệu triplet tại δ 0,84 (3H, t, J= 7,5 Hz).
Phổ 13C-NMR và DEPT có 29 carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 9 nhóm CH và 3 carbon bậc 4.
Từ tính chất vật lý, số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, tham khảo tài liệu [5], cho ta xác định hợp chất này là 3β-Stigmast-5-en-3-ol. Số liệu phổ đƣợc trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H1 Vị trí Vị trí 1H NMR 1C NMR 1H NMR 1C NMR 3 3.52 (1H,m) 71.8 19 1.01 (3H,s) 19.4 4 2.20-2.31 (2H,m) 42.3 21 0.92 (3H,d) 18.7 6 5.34 (1H,brd) 121.7 26 0.8 (3H,d) 19.0 18 0.68 (3H,s) 11.8 27 0.83 (3H,d) 19.8 29 0.84 (3H,t) 11.9
Hình 3. 11. Cấu trúc của H1: 3β-Stigmast-5-en-3-ol.
Từ đó nhận thấy trong phân đoạn H1, chất phân lập đƣợc là β-sitosterol. Nhƣ vậy dung môi chiết lần 2 chúng tôi lựa chọn là n-hexan để tách β-sitosterol
3.2.2. Khảo sát dung môi chiết mẫu lô hội thô ban đầu
Sau khi phân lập đƣợc β-sitosterol theo mục 3.2.1 chúng tôi tiến hành khảo sát dung môi chiết mẫu lô hội thô ban đầu với 2 loại dung môi là methanol và ethanol theo quy trình phân tích ở hình 3.12.
Sau đó tiến hành phân tích 2 dịch lọc trong 2 loại dung môi theo điều kiện đã khảo sát ở mục 3.1.4 chúng tôi thu đƣợc sắc đồ:
Hình 3. 13.Sắc đồ HPLC của β-sitosterol trong dịch chiết MeOH tại tốc độ dịng 0,8 ml/phút, hệ dung mơi ACN/AcOH 0,1%
Hình 3. 14. Sắc đồ HPLC của β-sitosterol trong dịch chiết EtOH tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1%
Từ sắc đồ trên, diện tích pic khi phân tích β-sitosterol với 2 loại dung mơi
Bảng 3. 3. Diện tích pic phân tích β-sitosteroltrong các hệ dung môi chiết khác nhau
Dung môi Diện tích (mAU.s)
Methanol 1379,38
Ethanol 938,63
Từ sắc đồ và bảng diện tích pic, chúng tơi nhận thấy, hình dạng pic khi phân tích β-sitosterol đƣợc chiết với dung môi MeOH cân xứng hơn, và cho diện tích pic lớn hơn khá nhiều với dung mơi chiết là EtOH. Từ đó chúng tơi lựa chọn dung mơi chiết là MeOH.
3.3. Đƣờng chuẩn xác định β-sitosterol 3.3.1.Dựng đƣờng chuẩn 3.3.1.Dựng đƣờng chuẩn
Từ dung dịch chuẩn gốc β-sitosterol 500 ppm, pha loãng các dung dịch
chuẩn làm việc với nồng độ 5-100 ppm. Mỗi dung dịch đƣợc tiến hành bơm trên hệ sắc ký 3 lần với các điều kiện tối ƣu đã khảo sát ở mục 3.1.4, diện tích pic trung bình sẽ đƣợc sử dụng để lập đƣờng chuẩn. Đƣờng chuẩn của chất β-sitosterol thể
hiện mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất.. Kết quả đƣợc thể hiện ởhình 3.15 và bảng 3.4.
Bảng 3. 4. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của β-sitosterol
Nồng độ (ppm) 5 10 20 40 50 100
Diện tích (mAU.s) 627,890 1232,81 2317,38 4712,68 6210,12 12037,41
Phƣơng trình
đƣờng chuẩn y = (120,71±4,106)x – (3,516±205,38)
Hình 3. 15. Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ β-sitosterol Từ đƣờng chuẩn thu đƣợc phƣơng trình hồi quy y = (120,71±4,106)x – Từ đƣờng chuẩn thu đƣợc phƣơng trình hồi quy y = (120,71±4,106)x – (3,5161±205,384) với hệ số tƣơng quan R2 = 0,999. Nhƣ vậy, đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic với nồng độ β-sitosterol tƣơng ứng là đạt yêu cầu và đƣợc chấp nhận.
3.3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng
Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xL ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích (yL) khác có ý nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Giới hạn phát hiện:
Sb là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng
k là đại lƣợng số học đƣợc chọn theo độ tin cậy mong muốn.
Trong trƣờng hợp khơng phân tích mẫu trắng thì có thể xem độ lệch chuẩn của mẫu trắng Sb đúng bằng sai số của phƣơng trình hồi quy, tức là Sb = Sy và tín hiệu phân tích mẫu nền yb= a. Khi đó, tín hiệu thu đƣợc ứng với nồng độ phát hiện YLOD= a + k.Sy. Với độ tin cậy 95%, k=3. Sau đó dung phƣơng trình hồi quy có thể tìm đƣợc LOD. y = 120.7x - 3.516 R² = 0.999 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 20 40 60 80 100 120
xLOD= Giới hạn định lƣợng (LOQ)
LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Cơng thức tính giới hạn định lƣợng: LOQ= 3,33 LOD.
Từ sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ, ta tính đƣợc LOD, LOQ của β-sitosterol nhƣ trong bảng 3.5:
Bảng 3. 5. Bảng kết quả LOD, LOQ của β-sitosterol Chất Sy (độ lệch chuẩn của Chất Sy (độ lệch chuẩn của
phƣơng trình hồi quy)
b (độ dốc của phƣơng trình hồi quy) LOD (ppm) LOQ (ppm) β- sitosterol 1,489 120,71 0,037 0,123
3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
3.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp xử lý mẫu
Độ lặp lại của q trình xử lí mẫu đƣợc thực hiện bằng cách cân cùng 1 khối lƣợng mẫu lô hội. Mẫu đƣợc cân và chuyển vào 3 bình, tiến hành quy trình xử lý mẫu đã đƣa ra ởhình 3.12, các điều kiện chạy HPLC nhƣ đã khảo sát ở mục 3.1.4. Kết quả độ lặp lại đƣợc thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3. 6. Độ lặp lại quy trình phân tích β-sitosteroltrong mẫu lô hội thô Lần 1(mg/g) m=105,0102g Lần 2 (mg/g) m= 104,2078g Lần 3 (mg/g) m= 103,1087 Trung bình (mg/g) %RSD 11,877 11,829 12,155 11,954 1,47
Từ bảng nhận thấy, % RSD giữa hàm lƣợng β-sitosterol trong các lần xử lý mẫu khá tốt, đều nhỏ hơn 5%, từ đó cho thấy q trình xử lý mẫu có độ lặp lại tin cậy đƣợc.
3.4.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp
Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu là một trong những đại lƣợng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp. Nó cho biết lƣợng chất bị mất đi trong quá trình xử lý mẫu. Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp xử lý mẫu đã chọn.
Để đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp, chúng tôi đã lựa chọn một loại mẫu không phát hiện β-sitosterol, chúng tôi lựa chọn mẫu trà thảo dƣợc, thêm
chuẩn vào mẫu đó và xử lý theo quy trình đƣa ra ở hình 3.12, các điều kiện chạy HPLC đã khảo sát ở mục 3.1.4 và tiến hành phân tích hàm lƣợng β-sitosterol.
Mẫu đƣợc cân khối lƣợng khoảng 0,2-0,3g trên cân phân tích, chuyển vào bình 15ml. Nồng độ đƣợc thêm vào tính theo sau khi định mức.
Bình 0: mẫu trắng, chỉ chứa 10 ml acetonitril. Bình 1 và 2: chỉ chứa lƣợng mẫu đã cân.
Bình 3 và 4: mẫu đƣợc thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 5 ppm. Bình 5 và 6: mẫu đƣợc thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 10 ppm. Bình 7 và 8: mẫu đƣợc thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 20 ppm. Tất cả các bình sau đó đƣợc thêm ACN đến 10 ml.
Các mẫu đƣợc xử lý cùng nhau, và tiến hành bơm vào cột sắc ký. Các sắc đồ đƣợc thể hiện trên các hình 3.16, 3.17, 3.18.
Hình 3. 17. Sắc đồ HPLC mẫu khơng chứa β-sitosterol
Hình 3. 18.Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 5 ppm.
Hình 3. 20. Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 20 ppm. Từ sắc đồ, nhận thấy khi tiến hành phân tích β-sitosteroltrên nền mẫu thảo Từ sắc đồ, nhận thấy khi tiến hành phân tích β-sitosteroltrên nền mẫu thảo
dƣợc có xuất hiện các chất đi kèm khá giống chất đi kèm khi phân tích mẫu lơ hội, đây có thể là sự xuất hiện của một số chất cùng nằm trong nhóm steroid, là những chất có trong thảo dƣợc và lơ hội.Kết quả diện tích pic của các mẫu thêm chuẩn đƣợc thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3. 7. Kết quả diện tích pic đánh giá hiệu suất thu hồi β-sitosterol
Diện tích pic trung bình (mAu)
Mẫu Mẫu thêm 5ppm Mẫu thêm 10ppm Mẫu thêm 20ppm
Không phát hiện 598,921 1167,78 2297,36
Từ đƣờng chuẩn, với các diện tích pic trên tính đƣợc nồng độ của các β- sitosterol thu hồi lại sau quá trình xử lý mẫu. kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng:
Bảng 3. 8. Kết quả hiệu suất thu hồi xác định β-sitosterol
Nồng độ β-sitosterol thu hồi đƣợc (ppm) Hiệu suất thu hồi (%)
Mẫu thêm 5ppm Mẫu thêm 10ppm Mẫu thêm 20ppm
4,99 9,75 19,2 97,7 ± 0,14
Hiệu suất thu hồi của các β-sitosterol khá cao, trung bình 97,7%, vì vậy có thể thấy phƣơng pháp xử lý mẫu này đáng tin cậy.
3.5. Phân tích mẫu thực tế
Sau khi đã khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình chạy HPLC và đánh giá phƣơng pháp phân tích đƣa ra, chúng tơi tiến hành phân tích hàm lƣợng β- sitosteroltrên mẫu lơ hội thực tế. Thực hiện quy trình xử lí mẫu đƣa ra ở hình 3.12,
sau đó tiến hành chạy máy HPLC theo các điều kiện đã khảo sát ở mục 3.1.4 chúng tôi xác định đƣợc hàm lƣợng β-sitosterol trong mẫu lô hội thực. Khối lƣợng
mẫu lô hội thô (sau khi sấy khô bằng tủ sấy) mthô = 104,1089 gam, mcặn = 0,5380 gam.Kết quả xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội đƣợc đƣa ra ở hình 3.17, 3.18, 3.19.
Hình 3. 21. Sắc đồ xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội ở lần đo 1
Hình 3. 23. Sắc đồ xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội ở lần đo 3
Từ sắc đồ trên chúng, dựa vào đƣờng chuẩn chúng tôi xác định đƣợc hàm lƣợng β-sitosterol trong dịch chiết cây lơ hội và tính tốn đƣợc hàm lƣợng β- sitosterol trong cây lô hội. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3. 9. Kết quả phân tích mẫu lơ hội thực tế
Lần đo Diện tích pic (mAu) Nồng độ β-sitosterol (ppm)
Lần 1 1395,69 11,59 ± 0,10
Lần 2 1379,38 11,46 ± 0,10
Lần 3 1402,42 11,65 ± 0,10
Trung bình 1392,50 11,57 ± 0,10
Từ kết quả thu đƣợc ở bảng 3.9, chúng tơi tính tốn đƣợc hàm lƣợng β- sitosterol trong dịch chiết từ cây lô hội (chiết với n-hexan) và trong mẫu cây lô hội.
Bảng 3. 10. Hàm lƣợng β-sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội
Lần đo Hàm lƣợng beta-sitosterol trong dịch chiết lô hội (mg/g)
Hàm lƣợng beta-sitosterol trong cây lô hội (mg/g)
Lần 1 23,183 11,877
Lần 2 22,913 11,829
Lần 3 23,294 12,038
Trung bình 23,130 11,954
%kl/kl 2,313 1,195
Nhƣ vậy, trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phƣơng pháp HPLC để xác định hàm lƣợng β-sitosteroltrong cây lô hội và
dịch chiết từ cây lô hội, chúng tôi đã xác định đƣợc hàm lƣợng β-sitosterol. Từ giá trị hàm lƣợng β-sitosterolnhận thấy, hàm lƣợng β-sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội tƣơng đối cao khoảng 2,313% với dịch chiết và 1,195% với cây lô hội.
KẾT LUẬN
Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu xác định hàm lƣợng β- sitosteroltrong cây lô hội và dịch chiết từ cây lơ hội bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả sau:
1. Nghiên cứu và tối ƣu đƣợc các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định β-sitosterolbao gồm: cột sắc kí là Acclain C 30 (5 μm; 4,6 x 250
mm); pha động ACN/AcOH 0,1%; tốc độ dòng 0,8 ml/phút; detector PDA (
max = 210nm).
2. Tối ƣu điều kiện để tách chiết β-sitosterolra khỏi nền mẫu: dung môi chiết là MeOH sau đó chiết tiếp với dung mơi n-hexan để tách β-sitosterol.
3. Xây dựng khoảng tuyến tính từ 5 đến 100 ppm và đƣờng chuẩn xác định β-
sitosteroly = (120,71±4,106)x – (3,5161±205,384); có hệ số tƣơng quan
tuyến tính R2> 0,999. Phƣơng pháp có giá trị LOD = 0,037 và LOQ = 0,124 , hiệu suất thu hồi 97,7%, giá trị RSD 1,47% đạt yêu cầu của AOAO.
4. Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích mẫu lô hội và đã xác định hàm lƣợng β-
sitosterolkhá cao trong dịch chiết và cây lô hội 2,313% trong dịch chiết lô
hội và 1,195% trong cây lô hội.
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tơi nhận thấy phƣơng pháp phân tích có độ nhạy cao, phân tích nhanh và chính xác, có thể áp dụng phân tích hàm lƣợng β- sitosterolvới độ tin cậy cao. Chúng tôi sẽ tiếp tục mở rộng phƣơng pháp để phân
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Võ Văn Chi (1991), Cây thuốc An Giang, NXB Uỷ Ban Khoa Học Kỹ Thuật An Giang
2. Ðỗ Thanh Hội (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kỹ Thuật.
3. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, Hà Nội. 4. Phạm Hoàng Hộ (2001), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, Hà Nội.
5. Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hoá học,
Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tiếng Anh
6. Abidi S.L., (2001), ―Chromatographic analysis of plant sterols in foods and vegetable oils‖, J. Chromatogr A, 935 (1-2), pp. 173-201.
7. Awad AB, Fink CS, (2000), ―Phytosterols as anticancer dietary components: evidence and mechanism of Action‖, J. Nutr, 130, pp. 2127-2130.
8. Akshada N. Kakade* and C.S. Magdum, (2012), ―HPLC analysis of β-sitosterol in herbal medicine and vegetable oils‖, International Journal of pharmacy & Life sciences, Vol.3, pp. 1666-1669.
9. Anilkumar KR, Sudarshankrishna KR, Chandramohan G, Ilayaraja N, Khanum F, Bawa AS., (2010), ―Effect of Aloe vera gel extract on antioxidant enzymes and azoxymethane induced oxidative stress in rats‖, Ind J Exp Biol, 48, pp. 837–842. 10. Boudreau MD, Beland FA., (2006), ―An evaluation of the biological and toxicological properties of Aloe barbadensis (Miller), Aloe vera‖. J Environ Sci Health, 24, pp. 103–154.
11. Bozzi A. *, Perrin C., Austin S., Arce Vera F. ( 2007), ―Quality and authenticity of commercial aloe vera gel powders‖. Food Chemistry,103, pp. 22-30.
12. Bruce, W. G. G., (1967), ―Investigations of antibacterial activity in the Aloe‖,
South African Medical Journal, Vol41, p. 984.
13. Capasso F., Borrelli E., Capasso R., Di Carlo G., Izzo A.A., Pinto L., Mascolo N., Castaldo S., Longo R., (1998), ―Aloe and its therapeutic use‖, Phytother. Res,
14. Chithra P., Sajithlal G.B., Chandrakasan G., (1998), ―Influence of Aloe vera on the healing of dermal wounds in diabetic rats‖, J. Ethnopharm, Vol 59, pp. 195-