Đƣờng chuẩn xác địnhβ-sitosterol

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu tách và định lượng beta sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội (Trang 40)

3.3.1.Dựng đƣờng chuẩn

Từ dung dịch chuẩn gốc β-sitosterol 500 ppm, pha loãng các dung dịch

chuẩn làm việc với nồng độ 5-100 ppm. Mỗi dung dịch đƣợc tiến hành bơm trên hệ sắc ký 3 lần với các điều kiện tối ƣu đã khảo sát ở mục 3.1.4, diện tích pic trung bình sẽ đƣợc sử dụng để lập đƣờng chuẩn. Đƣờng chuẩn của chất β-sitosterol thể

hiện mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất.. Kết quả đƣợc thể hiện ởhình 3.15 và bảng 3.4.

Bảng 3. 4. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của β-sitosterol

Nồng độ (ppm) 5 10 20 40 50 100

Diện tích (mAU.s) 627,890 1232,81 2317,38 4712,68 6210,12 12037,41

Phƣơng trình

đƣờng chuẩn y = (120,71±4,106)x – (3,516±205,38)

Hình 3. 15. Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ β-sitosterol Từ đƣờng chuẩn thu đƣợc phƣơng trình hồi quy y = (120,71±4,106)x – Từ đƣờng chuẩn thu đƣợc phƣơng trình hồi quy y = (120,71±4,106)x – (3,5161±205,384) với hệ số tƣơng quan R2 = 0,999. Nhƣ vậy, đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic với nồng độ β-sitosterol tƣơng ứng là đạt yêu cầu và đƣợc chấp nhận.

3.3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng

Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xL ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích (yL) khác có ý nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.

Giới hạn phát hiện:

Sb là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng

k là đại lƣợng số học đƣợc chọn theo độ tin cậy mong muốn.

Trong trƣờng hợp khơng phân tích mẫu trắng thì có thể xem độ lệch chuẩn của mẫu trắng Sb đúng bằng sai số của phƣơng trình hồi quy, tức là Sb = Sy và tín hiệu phân tích mẫu nền yb= a. Khi đó, tín hiệu thu đƣợc ứng với nồng độ phát hiện YLOD= a + k.Sy. Với độ tin cậy 95%, k=3. Sau đó dung phƣơng trình hồi quy có thể tìm đƣợc LOD. y = 120.7x - 3.516 R² = 0.999 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 20 40 60 80 100 120

xLOD= Giới hạn định lƣợng (LOQ)

LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.

Cơng thức tính giới hạn định lƣợng: LOQ= 3,33 LOD.

Từ sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ, ta tính đƣợc LOD, LOQ của β-sitosterol nhƣ trong bảng 3.5:

Bảng 3. 5. Bảng kết quả LOD, LOQ của β-sitosterol Chất Sy (độ lệch chuẩn của Chất Sy (độ lệch chuẩn của

phƣơng trình hồi quy)

b (độ dốc của phƣơng trình hồi quy) LOD (ppm) LOQ (ppm) β- sitosterol 1,489 120,71 0,037 0,123

3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích

3.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp xử lý mẫu

Độ lặp lại của q trình xử lí mẫu đƣợc thực hiện bằng cách cân cùng 1 khối lƣợng mẫu lơ hội. Mẫu đƣợc cân và chuyển vào 3 bình, tiến hành quy trình xử lý mẫu đã đƣa ra ởhình 3.12, các điều kiện chạy HPLC nhƣ đã khảo sát ở mục 3.1.4. Kết quả độ lặp lại đƣợc thể hiện ở bảng 3.6.

Bảng 3. 6. Độ lặp lại quy trình phân tích β-sitosteroltrong mẫu lơ hội thô Lần 1(mg/g) m=105,0102g Lần 2 (mg/g) m= 104,2078g Lần 3 (mg/g) m= 103,1087 Trung bình (mg/g) %RSD 11,877 11,829 12,155 11,954 1,47

Từ bảng nhận thấy, % RSD giữa hàm lƣợng β-sitosterol trong các lần xử lý mẫu khá tốt, đều nhỏ hơn 5%, từ đó cho thấy q trình xử lý mẫu có độ lặp lại tin cậy đƣợc.

3.4.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp

Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu là một trong những đại lƣợng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp. Nó cho biết lƣợng chất bị mất đi trong quá trình xử lý mẫu. Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp xử lý mẫu đã chọn.

Để đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp, chúng tôi đã lựa chọn một loại mẫu không phát hiện β-sitosterol, chúng tôi lựa chọn mẫu trà thảo dƣợc, thêm

chuẩn vào mẫu đó và xử lý theo quy trình đƣa ra ở hình 3.12, các điều kiện chạy HPLC đã khảo sát ở mục 3.1.4 và tiến hành phân tích hàm lƣợng β-sitosterol.

Mẫu đƣợc cân khối lƣợng khoảng 0,2-0,3g trên cân phân tích, chuyển vào bình 15ml. Nồng độ đƣợc thêm vào tính theo sau khi định mức.

Bình 0: mẫu trắng, chỉ chứa 10 ml acetonitril. Bình 1 và 2: chỉ chứa lƣợng mẫu đã cân.

Bình 3 và 4: mẫu đƣợc thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 5 ppm. Bình 5 và 6: mẫu đƣợc thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 10 ppm. Bình 7 và 8: mẫu đƣợc thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 20 ppm. Tất cả các bình sau đó đƣợc thêm ACN đến 10 ml.

Các mẫu đƣợc xử lý cùng nhau, và tiến hành bơm vào cột sắc ký. Các sắc đồ đƣợc thể hiện trên các hình 3.16, 3.17, 3.18.

Hình 3. 17. Sắc đồ HPLC mẫu khơng chứa β-sitosterol

Hình 3. 18.Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 5 ppm.

Hình 3. 20. Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lƣợng β-sitosterol 20 ppm. Từ sắc đồ, nhận thấy khi tiến hành phân tích β-sitosteroltrên nền mẫu thảo Từ sắc đồ, nhận thấy khi tiến hành phân tích β-sitosteroltrên nền mẫu thảo

dƣợc có xuất hiện các chất đi kèm khá giống chất đi kèm khi phân tích mẫu lơ hội, đây có thể là sự xuất hiện của một số chất cùng nằm trong nhóm steroid, là những chất có trong thảo dƣợc và lơ hội.Kết quả diện tích pic của các mẫu thêm chuẩn đƣợc thể hiện ở bảng 3.7.

Bảng 3. 7. Kết quả diện tích pic đánh giá hiệu suất thu hồi β-sitosterol

Diện tích pic trung bình (mAu)

Mẫu Mẫu thêm 5ppm Mẫu thêm 10ppm Mẫu thêm 20ppm

Không phát hiện 598,921 1167,78 2297,36

Từ đƣờng chuẩn, với các diện tích pic trên tính đƣợc nồng độ của các β- sitosterol thu hồi lại sau quá trình xử lý mẫu. kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng:

Bảng 3. 8. Kết quả hiệu suất thu hồi xác định β-sitosterol

Nồng độ β-sitosterol thu hồi đƣợc (ppm) Hiệu suất thu hồi (%)

Mẫu thêm 5ppm Mẫu thêm 10ppm Mẫu thêm 20ppm

4,99 9,75 19,2 97,7 ± 0,14

Hiệu suất thu hồi của các β-sitosterol khá cao, trung bình 97,7%, vì vậy có thể thấy phƣơng pháp xử lý mẫu này đáng tin cậy.

3.5. Phân tích mẫu thực tế

Sau khi đã khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình chạy HPLC và đánh giá phƣơng pháp phân tích đƣa ra, chúng tơi tiến hành phân tích hàm lƣợng β- sitosteroltrên mẫu lơ hội thực tế. Thực hiện quy trình xử lí mẫu đƣa ra ở hình 3.12,

sau đó tiến hành chạy máy HPLC theo các điều kiện đã khảo sát ở mục 3.1.4 chúng tôi xác định đƣợc hàm lƣợng β-sitosterol trong mẫu lô hội thực. Khối lƣợng

mẫu lô hội thô (sau khi sấy khô bằng tủ sấy) mthô = 104,1089 gam, mcặn = 0,5380 gam.Kết quả xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lơ hội đƣợc đƣa ra ở hình 3.17, 3.18, 3.19.

Hình 3. 21. Sắc đồ xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội ở lần đo 1

Hình 3. 23. Sắc đồ xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội ở lần đo 3

Từ sắc đồ trên chúng, dựa vào đƣờng chuẩn chúng tôi xác định đƣợc hàm lƣợng β-sitosterol trong dịch chiết cây lô hội và tính tốn đƣợc hàm lƣợng β- sitosterol trong cây lô hội. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.9.

Bảng 3. 9. Kết quả phân tích mẫu lơ hội thực tế

Lần đo Diện tích pic (mAu) Nồng độ β-sitosterol (ppm)

Lần 1 1395,69 11,59 ± 0,10

Lần 2 1379,38 11,46 ± 0,10

Lần 3 1402,42 11,65 ± 0,10

Trung bình 1392,50 11,57 ± 0,10

Từ kết quả thu đƣợc ở bảng 3.9, chúng tơi tính tốn đƣợc hàm lƣợng β- sitosterol trong dịch chiết từ cây lô hội (chiết với n-hexan) và trong mẫu cây lô hội.

Bảng 3. 10. Hàm lƣợng β-sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội

Lần đo Hàm lƣợng beta-sitosterol trong dịch chiết lô hội (mg/g)

Hàm lƣợng beta-sitosterol trong cây lô hội (mg/g)

Lần 1 23,183 11,877

Lần 2 22,913 11,829

Lần 3 23,294 12,038

Trung bình 23,130 11,954

%kl/kl 2,313 1,195

Nhƣ vậy, trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phƣơng pháp HPLC để xác định hàm lƣợng β-sitosteroltrong cây lô hội và

dịch chiết từ cây lô hội, chúng tôi đã xác định đƣợc hàm lƣợng β-sitosterol. Từ giá trị hàm lƣợng β-sitosterolnhận thấy, hàm lƣợng β-sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội tƣơng đối cao khoảng 2,313% với dịch chiết và 1,195% với cây lô hội.

KẾT LUẬN

Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu xác định hàm lƣợng β- sitosteroltrong cây lô hội và dịch chiết từ cây lơ hội bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả sau:

1. Nghiên cứu và tối ƣu đƣợc các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định β-sitosterolbao gồm: cột sắc kí là Acclain C 30 (5 μm; 4,6 x 250

mm); pha động ACN/AcOH 0,1%; tốc độ dòng 0,8 ml/phút; detector PDA (

max = 210nm).

2. Tối ƣu điều kiện để tách chiết β-sitosterolra khỏi nền mẫu: dung môi chiết là MeOH sau đó chiết tiếp với dung mơi n-hexan để tách β-sitosterol.

3. Xây dựng khoảng tuyến tính từ 5 đến 100 ppm và đƣờng chuẩn xác định β-

sitosteroly = (120,71±4,106)x – (3,5161±205,384); có hệ số tƣơng quan

tuyến tính R2> 0,999. Phƣơng pháp có giá trị LOD = 0,037 và LOQ = 0,124 , hiệu suất thu hồi 97,7%, giá trị RSD 1,47% đạt yêu cầu của AOAO.

4. Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích mẫu lơ hội và đã xác định hàm lƣợng β-

sitosterolkhá cao trong dịch chiết và cây lô hội 2,313% trong dịch chiết lô

hội và 1,195% trong cây lô hội.

Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tơi nhận thấy phƣơng pháp phân tích có độ nhạy cao, phân tích nhanh và chính xác, có thể áp dụng phân tích hàm lƣợng β- sitosterolvới độ tin cậy cao. Chúng tôi sẽ tiếp tục mở rộng phƣơng pháp để phân

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Võ Văn Chi (1991), Cây thuốc An Giang, NXB Uỷ Ban Khoa Học Kỹ Thuật An Giang

2. Ðỗ Thanh Hội (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kỹ Thuật.

3. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, Hà Nội. 4. Phạm Hoàng Hộ (2001), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, Hà Nội.

5. Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hoá học,

Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.

Tiếng Anh

6. Abidi S.L., (2001), ―Chromatographic analysis of plant sterols in foods and vegetable oils‖, J. Chromatogr A, 935 (1-2), pp. 173-201.

7. Awad AB, Fink CS, (2000), ―Phytosterols as anticancer dietary components: evidence and mechanism of Action‖, J. Nutr, 130, pp. 2127-2130.

8. Akshada N. Kakade* and C.S. Magdum, (2012), ―HPLC analysis of β-sitosterol in herbal medicine and vegetable oils‖, International Journal of pharmacy & Life sciences, Vol.3, pp. 1666-1669.

9. Anilkumar KR, Sudarshankrishna KR, Chandramohan G, Ilayaraja N, Khanum F, Bawa AS., (2010), ―Effect of Aloe vera gel extract on antioxidant enzymes and azoxymethane induced oxidative stress in rats‖, Ind J Exp Biol, 48, pp. 837–842. 10. Boudreau MD, Beland FA., (2006), ―An evaluation of the biological and toxicological properties of Aloe barbadensis (Miller), Aloe vera‖. J Environ Sci Health, 24, pp. 103–154.

11. Bozzi A. *, Perrin C., Austin S., Arce Vera F. ( 2007), ―Quality and authenticity of commercial aloe vera gel powders‖. Food Chemistry,103, pp. 22-30.

12. Bruce, W. G. G., (1967), ―Investigations of antibacterial activity in the Aloe‖,

South African Medical Journal, Vol41, p. 984.

13. Capasso F., Borrelli E., Capasso R., Di Carlo G., Izzo A.A., Pinto L., Mascolo N., Castaldo S., Longo R., (1998), ―Aloe and its therapeutic use‖, Phytother. Res,

14. Chithra P., Sajithlal G.B., Chandrakasan G., (1998), ―Influence of Aloe vera on the healing of dermal wounds in diabetic rats‖, J. Ethnopharm, Vol 59, pp. 195-

201.

15. Davis RH., Donato JJ., Hartman GM., et al, (1994), ―Anti-inflammatory and wound healing activity of a growth substance in Aloe vera‖, J Am Podiatr Med Assoc, 84, pp. 77-81.

16. Gerber, F.; Krummen, M.; Potgeter, H.; Roth, A.; Siffrin, C.; Spoendlin, C., (2004), ―Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid chromatography using 3μm particle packed columns and monolithic columns in pharmaceutical development and production working under current good manufacturing practice‖, Journal of Chromatography A, 1036 (2), pp. 127–133. 17. Grey V., Rouyer-Fessard C., Gammeltoft S., et al, (1991), ―Insulinlike growth factor II/mannose-6-phosphate receptors are transiently increased in the rat distal intestinal epithelium after resection‖, Mol Cell Endocrinol, 75, pp. 221-227.

18. Grindlay D., ReynoldsT., (1986), ―The Aloe vera phenomenon: A review of the properties and modern uses of the leaf parenchyma gel‖, Journal of Ethnopharmacology, Vol 16, pp. 117—151.

19. Holanda C.M.C.X., Costa M.B., Silva N.C.Z., Silva Junior M.F., Arruda Barbosa V.S., Silva R.P., Medeiros A.C, (2009), ―Effect of an extract of Aloe vera on the biodistribution of sodium pertehnetate (Na99m TcO4) in rats‖, Acta Cir. Bras, Vol 24, p.5.

20. Je-Chiuan Ye1, Wei-Chun Chang2, Dennis Jine-Yuan Hsieh3, and Meen-Woon Hsiao4*, (2010), ―Extraction and analysis of β-sitosterol in Herbal Medicines‖,

Journal of Medicinal Plants Research, Vol. 4(7), pp. 522-527.

21. Jones K., Aloe corp, (2005), ―The antidiabetic activity of Aloe vera‖, Cosmetic

Science Technology, 2, pp. 34-35.

22. Joshi S.P, (1998), ―Chemical constituents and biological activity of Aloe barbadensis‖ J. Med. Aromat.Plant, Vol 20, pp. 768-773.

23. Koo M.W.L., (1994), ―Aloe vera: Antiulcer and antidiabetic effects‖, Phytother

24. Kim K., Kim H., Kwon J., editors. et al., (2009), ―Hypoglycemic and hypolipidemic effects of processed Aloe vera gel in a mouse model of non-insulin- dependent diabetes mellitus‖, Phytomedicine, 16, pp. 856–863.

25. Ma Y.C., Kim H.Y., (1997), ―Determination of steroids by liquid chromatography/mass spectrometry‖, J. Of the Amerrican Society for Mass Spectrometry, Vol.8(9), pp. 1010-1020.

26. Miyuki T., Eriko M., Yousuke I., Noriko H., Kouji N., Muneo Y., Tomohiro T., Hirotoshi H., Mitunori T., Masanori I., Ryuuichi H., (2006), ―Identification of Five Phytosterols from Aloe Vera Gel as Anti-diabetic Compounds‖, Biol. Pharm.Bull,

Vol 29(7), pp. 1418-1422.

27. Misawa E., Tanaka M., Nomaguchi K., et al., (2012), ―Oral ingestion of Aloe vera phytosterols alters hepatic gene expression profiles and ameliorates obesity- associated metabolic disorders in zucker diabetic fatty rats‖, J Agric Food Chem,

60, pp. 2799–2806.

28. Newall C.A., Anderson L.A., Phillipson J.D., (1996), Herbal Medicines. A Guide for Health-Care Professionals, The Pharmaceutical Press, London.

29. Raksha Bawankar, Deepti V.C., Pooja Singh, Rathinasamy Subashkumar, Govindasamy Vivekanandhan1 and Subramanian Babu, (2012),‖ Evaluation of Bioactive Potential of an Aloe vera Sterol Extract‖, Phytother. Res, 27, pp. 864-

868.

30. Rajnish G., Anil K. S., M.P. Dobhal., M.C. Sharma, R.S. Gupta., (2011), ―Antidiabetic and antioxidant potential of b-sitosterol in streptozotocin-induced experimental hyperglycemia‖, Journal of Diabetes, Vol 3, pp. 29–37.

31. Rajasekaran S., Ravi K., Sivagnanam K., Subramanian S., (2006), ―Beneficial effects of Aloe vera leaf gel extract on lipid profile status in rats with streptozotocin diabetes‖, Clin Exp Pharmacol Physiol, 33(3), pp. 232–237.

32. Reynolds T., Dweck AC., (1999), ―Aloe vera leaf gel: a revise update‖, J Ethnopharmacol, 68, pp. 3–37.

33. Seongwon Choi and Myung-Hee Chung, (2003), ―A review on the relationship between Aloe vera components and their biological effects‖, Seminars in Integrative Medicine, 1, pp. 53-62.

34. Shimada K., Higashi T., Mitamuara K., (2003), ―Developmemt of analyses of biological steroids using chromatography‖, Chromatography, Vol 24(1).

35. Tanaka M1., Misawa E., Ito Y., Habara N., Nomaguchi K., Yamada M., Toida T., Hayasawa H., Takase M., Inagaki M., Higuchi R., (2006), ―Identification of five phytosterols from Aloe vera gel as anti-diabetic compounds‖, Biol Pharm Bull,

29(7), pp. 1418-1422.

36. Urch, David, (1999), ―Aloe vera Nature’s Gift, Great Britain”, Blackdow Publications, p. 15.

37. Vogler B.K., Ernst E., (1999), ―Aloe vera: A systematic review of its clinical effectiveness‖, Br.J.Gen. Pract, Vol 49, pp. 823-828.

38. Yagi T., Yamauchi K., (1999), ―Synergistic effects of anthraquinones on the purgative activity of rhein anthrone in mice‖, J Pharm Pharmacol, 51, pp. 93-95. 39. Zak A., Vecka M., Tvrzicka E., Hruby M., Novak F., Papezova H., Lubanda H., Vesela L., Stankova B., (2005), ―Composition of Plasma Fatty Acids and Non-

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu tách và định lượng beta sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội (Trang 40)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(54 trang)