1.4.1 .DNA ribosome(rDNA)trong hệ gen nhân
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1.2. Tách ADN tổng số
Tách ADN tổng số từ mẫu phân sử dụng bộ kít Qiagen DNA stool mini kit. Tách ADN từ con sán trưởng thành bằng phương pháp chelex 100-10%.
2.2.1.3. Thiết kế mồi LAMP
Tìm kiếm trình tự gen đích là gen ty thể nad1 của C. sinensis trên NCBI,
khảo sát lựa chọn vùng bảo thủ, thiết kế các bộ mồi LAMP sử dụng phần mềm Primer Explorer v.5 (https://primerexplorer.jp/e/). Kiểm tra tính đặc hiệu lý thuyết của mồi bằng Primer Blast trình tự mồi trên Genbank.
2.2.1.4. Lựa chọn bộ mồi LAMP, khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi thiết kế
Tiến hành khảo nghiệm các bộ mồi thiết kế bằng kỹ thuật LAMP với thành phần và điều kiện phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất enzym Bst DNA
Polymerase. Lựa chọn bộ mồi có độ nhạy cao hơn để khảo sát tính đặc hiệu mồi.
Khảo sát tính đặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm PCR và giải trình tự sản phẩm PCR.
+ Thí nghiệm thứ nhất: Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi F3 và 3 được thiết
kế để nhân bản vùng gen đích, sản phẩm PCR được giải trình tự để thẩm định kết quả đúng là trình tự của lồi sán lá gan nhỏ so với các trình tự chuẩn được cơng bố trên ngân hàng gen và đồng thời tìm kiếm trình tự tương đồng bằng chương trình last trên NC I để rút ra kết luận về tính đặc hiệu của sản phẩm PCR thu được.
+ Thí nghiệm thứ hai: Khảo sát sự bắt cặp chéo giữa mồi thiết kế cho C. sinensis với một số loài ký sinh trùng đường ruột khác như sán lá ruột
Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, sán lá gan lớn trưởng thành Fasciola gigantica, giun đũa….
2.2.1.5. Khảo sát tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP, thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người.
Tiến hành khảo sát tối ưu các điều kiện của kỹ thuật LAMP. Các yếu tố cần tối ưu bao gồm: Nhiệt độ và thời gian phản ứng, nồng độ mồi, nồng độ MgCl2 chất hiện màu phát hiện sản phẩm của phản ứng LAMP....
Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật dựa trên dãy nồng độ dãy pha lỗng chứng dương.
Viết quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người
2.2.1.6. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệucủa kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người.
Với mong muốn quy trình kỹ thuật LAMP đạt được độ nhạy ≥ 95%, độ đặc hiệu ≥ 95%, tính tốn cỡ mẫu cần có để thử nghiệm theo cơng thức sau:
+ Ước lượng số mẫu dương tính để đánh giá độ nhạy cần có:
(Nse) = TP+FN = [Z21-α Pse (1- Pse)/W2]/P = [(1,96)2 (0,95 x 0,05)]/(0,1)2/0,25 = 73 mẫu
+ Ước lượng số mẫu âm tính để đánh giá độ đặc hiệu (Nsp) được xác định bằng công thức:
Nsp = TN+FP = [Z21-α Psp (1- Psp)/W2]/(1-P) = [(1,96)2 (0,95 x 0,05)/(0,1)2]/0,75 =24,33 mẫu
Trong đó:
Độ nhạy mong đợi của kỹ thuật LAMP (Pse): 95% Độ đặc hiệu mong đợi củakỹ thuật LAMP (Psp): 95%
Sai số ước tính của hai xác suất Pse và Psp (W): 10% Độ tin cậy (giá trị α = 0,05): 95%
Tỷ lệ (P) dương tính với sán lá gan nhỏ ở người dân có nguy cơ nhiễm cao ước tính khoảng 25% [7].
TP: Dương tính thật (true positives) FP: Dương tính giả (fasle positives) TN: Âm tính thật (true negatives) FN: Âm tính giả (false negatives)
Mẫu được xác định là dương tính khi có kết quả xét nghiệm dương tính đồng thời bằng cả 2 kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR.
Mẫu được xác định âm tính khi có kết quả xét nghiệm âm tính đồng thời bằng cả 2 kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR.
Từ kết quả tính được ở trên, nghiên cứu lựa chọn 100 mẫu trong đó 73 mẫu dương, 27 mẫu âm tính với C. sinensis để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu.
Các bƣớc tiến hành lựa chọn mẫu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu nhƣ sau:
+ Chọn chủ đích 100 mẫu phân được thu thập từ thực địabao gồm toàn bộ các mẫu phân dương tính và cịn lại là các mẫu phân âm tính với xét nghiệm Kato-Katz để thực hiện xét nghiệm bằng kỹ thuật real time PCR.
+ Các mẫu phân dương tính, âm tính đồng thời bằng hai kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR được lựa chọn để thiết lập bộ mẫu 100 mẫu gồm có 73 mẫu dương, 27 mẫu âm tính với C. sinensis để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu. - Đánh giá khả năng lai chéo của kỹ thuật LAMP với các loài sán, giun khác:
Sử dụng các loài sán, giun khác để thử nghiệm gồm: O. viverrini, Haplorchis
taichui, H. pumilio; Fasiola gigantica, Paragonimus heterotremus, Teania saginata, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides thu thập từ người hoặc động vật, mỗi loài: 01 mẫu.