Kết quả khảo sát cho thấy cả 4 nồng độ HN được sử dụng đều không ức chế với phản ứng LAMP, màu hiển thị của dung dịch ở mẫu chứng âm xanh đậm
80 µM 100 µM 120 µM 140 µM
hơn ở nồng độ HNB cao so với nồng độ thấp. Quan sát bằng mắt thường có thể phân biệt được rõ ràng mẫu dương tính và mẫu âm tính.
Để tăng tính khách quan trong nhận định kết quả, một thí nghiệm phản ứng LAMP với 4 nồng độ được tiến hành trên cùng 1 mẫu chứng dương, 1 mẫu chứng âm, kết quả phản ứng LAMP được đọc bằng mắt thường bởi 3 người khác nhau, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả đánh giá khả năng phân biệt mẫu dương tính và âm tính khi sử dụng HN được tổng hợp ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả phát hiện sản phẩm LAMP sử dụng HNB bằng mắt thƣờng Nồng
độ HNB
Mẫu xét nghiệm
Đánh giá kết quả LAMP Âm tính (Màu xanh thẫm) Dƣơng tính (M u xanh dƣơng) Số lượng % Số lượng % 80 µM Chứng âm (n=12) 12 100 0 0 Chứng dương (n=12) 0 0 12 100 100 µM Chứng âm (n=12) 12 100 0 0 Chứng dương (n=12) 0 0 12 100 120 µM Chứng âm (n=12) 12 100 0 0 Chứng dương (n=12) 0 0 12 100 140 µM Chứng âm (n=12) 12 100 0 0 Chứng dương (n=12) 0 0 12 100
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy HNB không ức chế phản ứng LAMP, các kết quả xét nghiệm đều cho kết quả chính xác. Sự thay đổi màu giữa mẫu âm tính và dương tính có thể nhận định dễ dàng bằng mắt thường với kết quả đọc của 3 người tham gia cùng một thí nghiệm là tương đồng nhau. Nồng độ HNB 100µM là phù hợp để sử dụng cho phản ứng LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis. Kết quả này tương đồng với một số tác giả khác cũng sử dụng HNB làm chất chỉ thị màu trong đánh giá kết quả phản ứng LAMP[22].
3.1.2.8. Kết quả khảo sát xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng LAMP
Để xác định độ nhạy của phản ứng LAMP sử dụng chứng dương là ADN tái tổ hợp đoạn trình tự gen nad1của C. sinensis được pha loãng với nồng độ khác
nhau. Nghiên cứu này sử dụng 10 nồng độ pha loãng từ 10-3 ng/µl đến 10-12 ng/µl. Tiến hành đánh giá đồng thời bằng 2 thử nghiệm phản ứng LAMP, mỗi thử nghiệm lặp lại 3 lần.
Thử nghiệm 1: Thực hiện phản ứng LAMP không sử dụng chất chỉ thị màu HNB với dãy nồng độ pha loãng ADN trên, phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarosel 2%. Kết quả điện di sản phẩm LAMP thể hiện ở hình 3.14.
Hình 3.14.Kết quả khảo sát ngƣỡng phát hiện LAMP xác định C. sinensis
L: Thang đo 100 bp 1: Chứng âm (nước khử ion)
2-11: Sản phẩm LAMP với nồng độ ADN khuôn lần lượt là 10-3, 10-4, 10-5; 10-6, 10-7; 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12 ng/µl.
Với phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP bằng điện di trên gel agarose 2% Kết quả tại hình 3.14 cho thấy, giếng 1 chứng âm cho kết quả âm tính, từ giếng 2-8 các băng mục tiêu xuất hiện rõ ràng, giếng 9,10,11 không phát hiện được băng mục tiêu. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật LAMP được xác định là 10-9 ng/µl.
Thử nghiệm 2: Thực hiện phản ứng LAMP sử dụng chất chỉ thị màu HNB với dãy nồng độ pha loãng ADN trên, phát hiện sản phẩm bằng mắt thường dựa trên sự chuyển màu của dung dịch phản ứng. Kết quả sản phẩm LAMP thể hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15. Kết quả khảo sát ngƣỡng phát hiện của phản ứng LAMP xác định
C. sinensis sử dụng chất chỉ thị m u HNB
1: Chứng âm (nước khử ion)
2-11: Sản phẩm LAMP với nồng độ ADN khuôn lần lượt là 10-3, 10-4, 10-5; 10-6, 10-7; 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12 ng/µl.
Với phương pháp phát hiện trực tiếp sản phẩm LAMP bằng chất chỉ thị màu HNB: giếng 1 chứng âm cho kết quả màu xanh thẫm, từ giếng 2-8 phản ứng tổng hợp ADN xảy ra nên dung dịch chuyển thành màu xanh da trời, giếng 9,10,11 cho kết quả âm tính, thí nghiệm lặp lại 3 lần cho kết quả tương tự. Như vậy độ nhạy của LAMP khi không sử dụng chất chỉ thị màu và có sử dụng HNB 100 µM cho kết quả tương đương nhau. Ngưỡng giới hạn phát hiện của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis ở nồng độ là 10-9
ng/µl ADN tái tổ hợp được chọn là ngưỡng giới hạn phát hiện để tạo chứng dương cho kỹ thuật LAMP.
Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tơi đã thiết lập được quy trình kỹ thuật LAMP phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người với các thông số và điều kiện thực hiện kỹ thuật chính như sau:
Mồi LAMP thiết kế sử dụng cho quy trình gồm 4 mồi có ký hiệu và trình tự như sau: CS-Nad1-F3: 5’-CTCATGATGGTGGGTGTG-3’ CS-Nad1- 3: 5’-CCAAAGCGCATATTATAACAATG=3’ CS-Nad1-FIP: 5’-CAACCCTTAAAACCCTATAACCAGTTTTGTTCAGTGACGCTTTTGTG-3’ CS-Nad1-BIP: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
5’-GTTGGGGGTCGTATAAAAAGTTTGTTTTAAAACAGGCCTCGAATGT-3 Thành phần và nồng độ hóa chất tham gia phản ứng LAMP gồm:
1X ThermoPol Reaction Bufrer 8 mM MgSO4
1,4 mM dNTP 10 mM
0,2 µM mồi CS-Nad1-F3; 0,2 µM mồi CS-Nad1-B3; 1,6 µM mồi CS-Nad1- FIP; 1,6 µM mồi CS-Nad1-BIP
1 µl Bst DNA polymerase 100 µM HNB
Thể tích ADN khn tổng số: 4 µl
Nước khử ion vừa đủ cho phản ứng LAMP trong tổng thể tích 25 µl. Điều kiện và thời gian ủ của phản ứng LAMP
630C trong 60 phút, 800C trong 5 phút.
Giới hạn phát hiện: 10-9ng/µl ADN của C. sinensis
3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis trên ngƣời
3.2.1. Kết quả điều tra thu thập mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành
Đề tài đã tiến hành điều tra thu mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành ở người dân tại xã Yên Lộc, huyện im Sơn, tỉnh Ninh ình. Các đối tượng nghiên cứu được lựa chọn là nhóm có nguy cơ nhiễm sán lá gan nhỏ cao với các tiêu chuẩn lựa chọn như sống trong vùng dịch tễ ít nhất 03 năm, từng ăn gỏi cá, có một số biểu hiện lâm sàng như đau bụng, mệt mỏi, chán ăn, rối loạn tiêu hóa, khó tiêu, từ 18 tuổi trở lên và tự nguyện tham gia nghiên cứu. Các mẫu phân được xét nghiệm tìm trứng trong phân bằng kỹ thuật Kato-Katz. Bệnh nhân nhiễm trứng sán lá gan nhỏ được điều trị theo Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị do Bộ Y tế ban hành [1]. Bệnh nhân nhiễm trứng sán lá gan nhỏ với cường độ cao được uống thuốc tẩy, đãi phân để thu thập sán lá gan nhỏ trưởng thành.
Kết quả điều tra đã thu được 309 mẫu phân từ người dân để xét nghiệm Kato-Katz tìm trứng sán lá gan nhỏ và trứng giun, sán khác (bảng 3.3).
Bảng 3.3. Kết quả xét nghiệm phân bằng kỹ thuật Kato-Katz Kết quả xét nghiệm Số lƣợng Tỷ lệ % Kết quả xét nghiệm Số lƣợng Tỷ lệ % Dƣơng tính Trứng sán lá gan nhỏ 66 21,36 Trứng các loài giun, sán khác 22 7,12
Âm tính Khơng phát hiện trứng giun,
sán 221 71,52
Tổng 309 100
ằng kỹ thuật ato-Katz đã phát hiện được 66/309 người nhiễm trứng sán lá gan nhỏ với tỷ lệ nhiễm là 21,36%, kết quả này tương đồng với kết quả của một số kết quả điều tra gần đây được tiến hành bởi Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng trung ương [7], [10].
Trong 66 người nhiễm trứng sán lá gan nhỏ, có 5 người nhiễm trứng sán với cường độ cao được lựa chọn uống thuốc để tẩy, đãi thu sán lá gan nhỏ trưởng thành. ết quả tẩy sán thu được sán lá gan nhỏ trưởng thành ở 3/5 người ( ảng 3.4).
Bảng 3.4. Kết quả tẩy, đãi thu sán lá gan nhỏ C. sinensis STT Mã số Số sán lá gan nhỏ thu đƣợc (con)
1 NB0014T 31 2 NB0039T 19 3 NB0062T 0 4 NB0146T 1 5 NB0149T 0 Tổng 51
Các con sán trưởng thành được bảo quản trong cồn 700 và vận chuyển về phịng thí nghiệm để sử dụng cho nghiên cứu thiết lập quy trình và đánh giá, thử nghiệm khác.
3.2.2. Kết quả thiết lập bộ mẫu sử dụng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis
Đến nay, phát hiện trứng sán lá gan nhỏ trong phân được coi là chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh sán lá gan nhỏ. Tuy nhiên do cường độ nhiễm trứng trong phân thấp nên khi xét nghiệm bằng kỹ thuật Kato-Katz có thể bỏ sót các trường hợp
nhiễm trứng với cường độ thấp hoặc có thể do lượng trứng trong phân ít dẫn đến quá trình tách AND đạt yêu cầu cho kỹ thuật real time PCR. Hơn nữa, do hình thái trứng sán lá gan nhỏ C. sinensis không thể phân biệt được với trứng của các loài sán lá gan nhỏ khác, dễ nhầm lẫn với trứng sán lá ruột nhỏ nên việc định loại chính xác trứng sán lá gan nhỏ cịn phụ thuộc vào trình độ và kinh nghiệm của kỹ thuật viên nên có thể có những trường hợp dương tính với Kato- atz nhưng âm tính với real time PCR [39].
Chúng tôi tiến hành xét nghiệm cho 100 mẫu phân thu thập từ đợt điều tra trong đó có 66 mẫu phân nhiễm trứng sán lá gan nhỏ C. sinensis và 34 mẫu phân không nhiễm trứng sán lá gan nhỏ bằng kỹ thuật real time PCR.Kết quả xét nghiệm cho thấy có 59/66 mẫu dương tính với sán lá gan nhỏ chiếm tỷ lệ 89,39%, có 7/66 mẫu dương tính với Kato- atz nhưng âm tính với real time PCR chiếm tỷ lệ (10,61%), 34/34 mẫu âm tính với cả 2 kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR.
Từ kết quả trên, chúng tôi thiết lập bộ 100 mẫu giả định sử dụng cho đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP trong đó có 73 mẫu dương tính và 27 mẫu âm tính với sán lá gan nhỏ bằng đồng thời cả 2 kỹ thuật Kato-Katz và Real time PCR từ mẫu phân sao cho có được tỷ lệ tương đối đồng đều ở các cường độ nhiễm trứng trong phân (Bảng 3.5).
Bảng 3.5Kết quả thiết lập bộ mẫu đểđánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP
Loại mẫu Số lƣợng
Mẫu phân nhiễm trứng sán lá gan nhỏ < 100 trứng/ 1gram phân 27 Mẫu phântrứng sán lá gan nhỏ từ 100 đến < 1000 trứng/ 1gram
phân 23
Mẫu phântrứng sán lá gan nhỏ> 1000 trứng/ 1gram phân 23
Mẫu phân không nhiễm trứng sán lá gan nhỏ 27
Tổng 100
3.2.3. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP phát hiện C. sinensis trên người C. sinensis trên người
3.2.3.1. Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình kỹ thuật LAMP trên bộ mẫu giả định
Thực hiện phản ứng LAMP xét nghiệm 100 mẫu giả định theo quy trình được thiết lập ở trên. Kết quả xác định được có 72/73 (98,63%) mẫu dương tính cho kết quả xét nghiệm LAMP dương tính, 28 mẫu cho kết quả xét nghiệm LAMP âm tính với sán lá gan nhỏ C. sinensis. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP so với kết quả tham chiếu bằng Kato- atz và real time PCR được trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis tại phịng thí nghiệm
Kato-Katz và real time
PCR Dương tính Âm tính Tổng Kỹ thuật LAMP Dương tính 72 0 72 Âm tính 1 27 28 Tổng 73 27 100
Sử dụng phần mềm Win episzcope 2.0, với độ tin cậy 95% để phân tích độ nhạy, độ đặc hiệu. Độ nhạy của kỹ thuật LAMP xác địnhC. sinensis khi đánh giá
trên các mẫu tham chiếu tại phịng thí nghiệm là 98,6%, độ đặc hiệu là 100%, giá trị tiên đoán dương là 100%, giá trị tiên đoán âm là 96,4%.
3.2.3.2. Kết quả khảo sát sự lai chéo của kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ với một số loài giun sán gây bệnh trên người
Thực hiện khảo sát trên 8 loài bao gồm O. viverrini, Haplorchis taichui, H.
pumilio; Fasiola gigantica, Paragonimus heterotremus, Teania saginata, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides. Kết quả xác định kỹ thuật LAMP
dương tính đặc hiệu với C. sinensis mà khơng lai chéo với các lồi giun, sán được thử nghiệm (Hình 3.16).
Hình 3.16.Kết quả khảo sát khả năng lai chéo của kỹ thuật LAMP với các lo i giun, sán gây bệnh trên ngƣời
Ống 1: Mẫu chứng âm; Ống 2: Sán lá gan nhỏ O. viverrini; Ống 3: Sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui; Ống 4: Sán lá gan nhỏ C. sinensis; Ống 5: Sán lá ruột nhỏ Haplorchis pumilo; Ống 6: Sán lá gan lớn F. gigantica; Ống 7: Sán lá phổi Paragonimus heterotremus; Ống 8: Sán dây Teania saginata; Ống 9: Giun móc Ancylostoma duodenale;
Ống 10: Giun đũa Ascaris lumbricoides; Ống 11: Chứng dương
Kết quả xét nghiệm cho thấy phản ứng LAMP đặc hiệu cho C.sinensis và khơng có sự lai chéo với các lồi giun sán khác.
hi so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP của nghiên cứu này với một số kết quả nghiên cứu trên thế giới gần đây thì thấy có sự tương đồng cao. Tuy sử dụng nguồn ADN từ nhiều nền mẫu khác nhau nhưng các kết quả nghiên cứu đều đánh giá LAMP có độ nhạy cao hơn PCR khoảng từ 100 đến 1000 lần [15], [31].
Nghiên cứu của Rahman và cs cho thấy LAMP phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ nhiễm trên mẫu phân người đạt độ nhạy là 100% với các mẫu nhiễm > 100 trứng/1 gram phân, đạt 93,1% với các mẫu nhiễm < 100 trứng/1 gram phân [39], nghiên cứu này cho độ nhạy 98,6%, do có sự sai khác kết quả ở 01 mẫu có cường độ nhiễm thấp < 100 trứng/ gram phân (Phụ lục 2). Trong các nghiên cứu đã báo cáo đều ghi nhận kỹ thuật LAMP đặc hiệu với sán lá gan nhỏ C. sinensis, không xảy ra hiện
tương lai chéo với một số loài sán, gium thường gặp nhiễm trên người [15], [18], [39].
Mặc dù độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP trong các báo cáo rất cao, tuy nhiên một số nghiên cứu cũng đưa ra những cảnh báo về nguy cơ tạp nhiễm trong quá trình thao tác kỹ thuật, do vậy việc tuân thủ quy trình xét nghiệm và sử dụng phương pháp phát hiện sản phẩm bằng chất nhuộm màu, hoặc huỳnh quang giúp hạn chế các nguy cơ tạp nhiễm [22].
KẾT LUẬN
1. Đã thiết lập thành cơng quy trình kỹ thuật LAMP chẩn đốn xác định nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người bao gồm thiết kế mồi LAMP đặc hiệu
với gen đíchnad1; đã tối ưu được các thành phần tham gia phản ứng LAMP với nồng độ 8,0 mM MgSO4, 1,4 mM dNTP mix, 0,2 µM mồi CS-Nad1-F3, 0,2 µM CS-Nad1-B3, 1,6 µM CS-Nad1-FIP, 1,6 µM CS-Nad1-BIP, 100 µM HNB, 4 µl ADN khn; điều kiện ủ của phản ứng LAMP là 630C, thời gian ủ
là 60 phút; giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP là 10-9 ng/µl ADN của
C. sinensis.
2. Quy trình kỹ thuật LAMP chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ
C. sinensis trên người có độ nhạy là 98,6%, độ đặc hiệu là 100%, giá trị tiên
đoán dương là 100%, giá trị tiên đoán âm là 96,4% khi đánh giá trên các mẫu giả định được thiết lập từ mẫu phân nhiễm trứng sán lá gan nhỏ tại phịng thí nghiệm. Quy trình LAMP khơng có sự lai chéo với 8 loài giun sán khác bao gồm O. viverrini, Haplorchis taichui, H. pumilio; Fasiola gigantica, Paragonimus heterotremus, Teania saginata, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu phát triển quy trình kỹ thuật để chế tạo bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ, ứng dụng trong cơng tác nghiên cứu, chẩn đốn và điều trị bệnh sán lá gan nhỏ cho người dân.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. ộ Y tế, (2004), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh sán lá gan nhỏ,
sán lá phổi, sán dây và bệnh ấu trùng sán lợn.
2. Nguyễn Văn Đề, P.V.T. (2012), Ký sinh trùng Y học. Giáo trình đào tạo
ác sỹ đa khoa, NX Y học, Hà Nội.
3. Lê Quang Huấn Hoàng Phú Hiệp (2011), " ỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) hướng đi mới trong việc tạo it phát hiện nhanh bệnh