1.4.1 .DNA ribosome(rDNA)trong hệ gen nhân
1.8. Các nghiên cứu về ứng dụng kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán C.sinensis
những năm gần đây
Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vòng trung gian (LAMP) được áp dụng để chẩn đoán nhanh nhiễm Clonorchis sinensis ở vật chủ trung gian là ốc nước ngọt. Nghiên cứu cho thấy giới hạn phát hiện của phương pháp LAMP đạt tới 10 fg, độ nhạy gấp 1000 lần so với PCR thông thường, điều này cũng được chứng minh bằng cách áp dụng thành công vào các mẫu thu từ thực địa. Phương pháp LAMP được thiết kế chỉ khuếch đại đặc hiệu DNA bộ gen của C. sinensis và không phản ứng chéo với những lồi từ các loại giun trịn khác. Những kết quả nghiên cứu đã khẳng định phương pháp LAMP là một phương pháp nhạy cao hơn so với PCR thông thường để phát hiện nhiễm C. sinensis ở các vật chủ trung gian đầu tiên và là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, lý tưởng cho các khảo sát dịch tễ học tại thực địa của loại ký sinh trùng này [18].
Cai và cộng sự (2010), đã nghiên cứu về ứng dụng LAMP trong chẩn đoánnhiễm ấu trùng C.sinensis trên vật chủ trung gian là cá nước ngọt. ộ mồi
LAMP được thiết kế trên gen cathepsins B3 của C. Sinensis cho thấy có độ đặc hiệu cao với C. sinensis, khơng lai chéo với các loài giun, sán khác. ết quả nghiên cứu cũng chứng minh được độ nhạy của kỹ thuật LAMP cao gấp 100 lần so với kỹ thuật PCR thông thường, kỹ thuật LAMP đơn giản và là cơng cụ có giá trị trong phát hiện nhanh, với độ nhạy, đặc hiệu cao trong phát hiện nhiễm C. sinensis trên cá nước
ngọt [14].
Sử dụng DNA ty thể được xem như có nhiều lợi thế so với gen đích nằm trong hệ gen nhân vì gen ty thể có số bản sao lớn hơn ở tế bào (đặc biệt là khi sử dụng nguồn DNA tách từ trứng) cho phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng. Lê Thanh Hòa và cộng sự (2012) đã thiết lập kỹ thuật LAMP với 4 mồi (F3, FIP (F1c + F2), BIP (B1c + B2) và B3) thiết kế dựa trên gen ty thể nad1 của
Opisthorchis viverrini. Kết quả thử nghiệm cho thấy kỹ thuật LAMP đặc hiệu với O. viverrini, khơng lai chéo với lồi sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis và một số
loài sán khác như Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, Fasciola hepatica và Fasciola gigantica. Sản phẩm LAMP có thể được phát hiện bằng mắt thường dưới
ánh sáng tự nhiên hoặc bằng phương pháp điện di trên gel (nhuộm bằng ethidium bromide) hoặcnhuộm SYBR Green I.Kỹ thuật LAMP có thể phát hiện được ở ngưỡng DNA100 fg (10-4
ng DNA), kết quả xét nghiệm bằng LAMP nhạy hơn từ 10 đến 100 lần so với PCR. Kết quả xét nghiệm trên các mẫu thực địa bằng cách sử dụng các mẫu trứng, ấu trùng (metacercarial) thu thập từ các vùng dịch tễ cho thấy kỹ thuật LAMP có nhiều ưu điểm như đơn giản, nhanh chóng, có độ nhạy cao và hiệu quả, LAMP là một công cụ tốt để cho các xét nghiệm phân tử và các nghiên cứu dịch tễ học ở các khu vực hoặc quốc gia có lưu hành O. viverrini, có thể giúp kiểm sốt bệnh sán lá gan nhỏ hiệu quả hơn [31].
Rahman và cộng sự (2017) nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP sử dụng gen coxI phát hiện sán lá gan nhỏ C. sinensis trên mẫu phân người. Kết quả thử
nghiệm xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật LAMP khoảng 100 fg, với khoảng 1 trứng/ 100 mg phân, độ nhạy với mẫu 100 trứng/1g phân đạt được 100%[39].
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu phân người nghi ngờ nhiễm trứng sán lá gan nhỏ C. sinensis. - Con sán lá gan nhỏ trưởng thành C. sinensis được tẩy từ người bệnh.
- Các loại giun sán khác: O. viverrini, Haplorchis taichui, H. pumilio; Fasiola
gigantica, Paragonimus heterotremus, Teania saginata, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu:
Từ tháng 01/2018 đến tháng 12/2019
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung Ương.
- Địa điểm thu thập mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành: Xã Yên Lộc, huyện im Sơn, tỉnh Ninh Bình.
2.1.4. Hóa chất, vật tư tiêu hao, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
- Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1 và Bảng 2.2
Bảng 2.1. Các hóa chất, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Nguồn gốc
1 QIAamp DNA Stool mini Kit QIAGEN
2 Chelex-100 resin Sigma-Aldrich (Đức)
3 Ethanol tuyệt đối Sigma-Aldrich (Đức)
4 Primers (Bảng 2.2) IDT (Mỹ)
5 dNTPs Thermo Scientific
6 Hot Start DNA Taq polymerase (5 units/µl)
QIAGEN
(8.000 units/µl)
8 2X FastGen Probe NIPPON Genetics Europe
9 Nước khử ion Omega Biotek
10 TBE 10X Serva
11 Ladder 100 bp Norgen Biotek Corp
12 Agarose Serva
13 Dung dịch nhuộm Redsafe Intron-Korea
14 Các hóa chất giải trình tự gen Hãng ABI 15 HNB (Hydroxy naphthol blue) Sigma-Aldrich (Đức) 16 DNA tái tổ hợp mang gen nad1 của
C. sinensis ( nồng độ 1 ng/µl)
Viện Sốt rét – KST-CTTW
Bảng 2.2. Trình tự các bộ mồi sử dụng cho LAMP, real time PCR
TT Tên mồi Trình tự (5’ 3') I Trình tự các mồi LAMP 1 CS-Nad1-F3 CTCATGATGGTGGGTGTG 2 CS-Nad1-B3 CCAAAGCGCATATTATAACAATG 3 CS-Nad1-FIP CAACCCTTAAAACCCTATAACCAGTTTTGTTCA GTGACGCTTTTGTG 4 CS-Nad1-BIP GTTGGGGGTCGTATAAAAAGTTTGTTTTAAAAC AGGCCTCGAATGT 5 HCS-Nad1-F3 GTTCAGTGACGCTTTTGTG 6 HCS-Nad1-B3 GTAATCACCACACACCAAAG 7 HCS-Nad1-FIP TATACGACCCCCAACCAACCTTTTGTTGCTTTT AATTACTAGGTTGAC 8 HCS-Nad1-BIP AAGTTTGCTCTTATAAGTTGTGTGCTTTTAATGC ACATAAAACAGGCC
II Trình tự mồi sử dụng Real time PCR
1 CSFQ-F AGCGATTCTAGTTCCGTCATCTG
2 CSFQ-R AGGTATAGCCAGGAATTGGTAGAAC
Các vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.3
Bảng 2.3. Danh mục vật tƣ tiêu hao chính sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên vật tƣ, tiêu hao Nguồn gốc
1 Filter tip 0,1-10 µl AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 2 Filter tip 1-100 µl AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 3 Filter tip 1-200 µl AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 4 Filter tip 100-1000 µl AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 5 Ồng eppendorf 1,5 ml AHN Biotechnologie GmbH (Đức)
6 Ống nhựa 2 ml AHN Biotechnologie GmbH (Đức)
7 Ống Fancol 15 ml AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 8 Ống Fancol 50 ml AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 9 Ống PCR 0,2 ml AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 10 Giấy paraffin AHN Biotechnologie GmbH (Đức)
11 Hộp lưu mẫu AHN Biotechnologie GmbH (Đức)
12 Găng tay không bột talc Malaysia
13 Khẩu trang y tế Việt Nam
14 Giấy lau Việt Nam
- Các máy, thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.4
Bảng 2.4. Danh mục máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Nguồn gốc
1 Máy ly tâm Eppendoft
2 Máy lắc, ủ nhiệt khô Eppendoft
3 Máy PCR Eppendoft
4 Máy real time PCR ABI 7500 ABI Thermor
5 Hệ thống điện di và chụp ảnh kỹ thuật số Geldoc 6 Hệ thống giải trình tự gen ABI 3500 ABI Thermo
7 Tủ an toàn sinh học cấp II Essco
8 Máy vortex I A (Đức)
9 Tủ sấy Sanyo
10 Tủ ấm Sanyo
11 Micropipet các loại điều chỉnh thể tích từ 0,1µl -1000 µl
Eppendorf
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật được thực hiện
theo sơ đồ sau:
9
Tối ưu các điều kiện của kỹ thuật LAMP, thiết lập
quy trình kỹ thuật LAMP 1. Nhiệt độ ủ 2. Thời gian phản ứng 3. Nồng độ Mg+ 4. Nồng độ mồi 5. Nồng độ dNTP
6. Lượng DNA đưa vào phản ứng
7. Chất chỉ thị mầu HNB 8. Ngưỡng phát hiện của phản ứng
Tách ADN tổng số Thu mẫu phân, mẫu sán
lá gan nhỏ C. sinensis trưởng thành
Thiết kế mồi LAMP
Khảo sát tính đặc hiệu, lựa chọn bộ mồi thiết kế
bằng PCR, giải trình tự gen, LAMP
Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật
LAMP xác định
2.2.1.1. Thu thập mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành
Tiến hành điều tra cắt ngang thu mẫu phân để xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ trên người bằng kỹ thuật Kato-Katz tại xã Yên Lộc, huyện im Sơn, tỉnh Ninh ình. Đối tượng lựa chọn là người dân sống tại địa phương, từ 18 tuổi trở lên, từng ăn gỏi cá, có một số biểu hiện lâm sàng như đau bụng, mệt mỏi, chán ăn, rối loạn tiêu hóa, khó tiêu và tự nguyện tham gia nghiên cứu.
Những bệnh nhân có cường độ nhiễm trứng trong phân > 1000 trứng/ gram phân được lựa chọn tẩy sán thu con sán trưởng thành.
Tổng số mẫu đã thu thập: 309 mẫu phân, 51 con sán trưởng thành.
2.2.1.2. Tách ADN tổng số
Tách ADN tổng số từ mẫu phân sử dụng bộ kít Qiagen DNA stool mini kit. Tách ADN từ con sán trưởng thành bằng phương pháp chelex 100-10%.
2.2.1.3. Thiết kế mồi LAMP
Tìm kiếm trình tự gen đích là gen ty thể nad1 của C. sinensis trên NCBI,
khảo sát lựa chọn vùng bảo thủ, thiết kế các bộ mồi LAMP sử dụng phần mềm Primer Explorer v.5 (https://primerexplorer.jp/e/). Kiểm tra tính đặc hiệu lý thuyết của mồi bằng Primer Blast trình tự mồi trên Genbank.
2.2.1.4. Lựa chọn bộ mồi LAMP, khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi thiết kế
Tiến hành khảo nghiệm các bộ mồi thiết kế bằng kỹ thuật LAMP với thành phần và điều kiện phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất enzym Bst DNA
Polymerase. Lựa chọn bộ mồi có độ nhạy cao hơn để khảo sát tính đặc hiệu mồi.
Khảo sát tính đặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm PCR và giải trình tự sản phẩm PCR.
+ Thí nghiệm thứ nhất: Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi F3 và 3 được thiết
kế để nhân bản vùng gen đích, sản phẩm PCR được giải trình tự để thẩm định kết quả đúng là trình tự của lồi sán lá gan nhỏ so với các trình tự chuẩn được cơng bố trên ngân hàng gen và đồng thời tìm kiếm trình tự tương đồng bằng chương trình last trên NC I để rút ra kết luận về tính đặc hiệu của sản phẩm PCR thu được.
+ Thí nghiệm thứ hai: Khảo sát sự bắt cặp chéo giữa mồi thiết kế cho C. sinensis với một số loài ký sinh trùng đường ruột khác như sán lá ruột
Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, sán lá gan lớn trưởng thành Fasciola gigantica, giun đũa….
2.2.1.5. Khảo sát tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP, thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người.
Tiến hành khảo sát tối ưu các điều kiện của kỹ thuật LAMP. Các yếu tố cần tối ưu bao gồm: Nhiệt độ và thời gian phản ứng, nồng độ mồi, nồng độ MgCl2 chất hiện màu phát hiện sản phẩm của phản ứng LAMP....
Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật dựa trên dãy nồng độ dãy pha lỗng chứng dương.
Viết quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người
2.2.1.6. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệucủa kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người.
Với mong muốn quy trình kỹ thuật LAMP đạt được độ nhạy ≥ 95%, độ đặc hiệu ≥ 95%, tính tốn cỡ mẫu cần có để thử nghiệm theo cơng thức sau:
+ Ước lượng số mẫu dương tính để đánh giá độ nhạy cần có:
(Nse) = TP+FN = [Z21-α Pse (1- Pse)/W2]/P = [(1,96)2 (0,95 x 0,05)]/(0,1)2/0,25 = 73 mẫu
+ Ước lượng số mẫu âm tính để đánh giá độ đặc hiệu (Nsp) được xác định bằng công thức:
Nsp = TN+FP = [Z21-α Psp (1- Psp)/W2]/(1-P) = [(1,96)2 (0,95 x 0,05)/(0,1)2]/0,75 =24,33 mẫu
Trong đó:
Độ nhạy mong đợi của kỹ thuật LAMP (Pse): 95% Độ đặc hiệu mong đợi củakỹ thuật LAMP (Psp): 95%
Sai số ước tính của hai xác suất Pse và Psp (W): 10% Độ tin cậy (giá trị α = 0,05): 95%
Tỷ lệ (P) dương tính với sán lá gan nhỏ ở người dân có nguy cơ nhiễm cao ước tính khoảng 25% [7].
TP: Dương tính thật (true positives) FP: Dương tính giả (fasle positives) TN: Âm tính thật (true negatives) FN: Âm tính giả (false negatives)
Mẫu được xác định là dương tính khi có kết quả xét nghiệm dương tính đồng thời bằng cả 2 kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR.
Mẫu được xác định âm tính khi có kết quả xét nghiệm âm tính đồng thời bằng cả 2 kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR.
Từ kết quả tính được ở trên, nghiên cứu lựa chọn 100 mẫu trong đó 73 mẫu dương, 27 mẫu âm tính với C. sinensis để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu.
Các bƣớc tiến hành lựa chọn mẫu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu nhƣ sau:
+ Chọn chủ đích 100 mẫu phân được thu thập từ thực địabao gồm toàn bộ các mẫu phân dương tính và cịn lại là các mẫu phân âm tính với xét nghiệm Kato-Katz để thực hiện xét nghiệm bằng kỹ thuật real time PCR.
+ Các mẫu phân dương tính, âm tính đồng thời bằng hai kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR được lựa chọn để thiết lập bộ mẫu 100 mẫu gồm có 73 mẫu dương, 27 mẫu âm tính với C. sinensis để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu. - Đánh giá khả năng lai chéo của kỹ thuật LAMP với các loài sán, giun khác:
Sử dụng các loài sán, giun khác để thử nghiệm gồm: O. viverrini, Haplorchis
taichui, H. pumilio; Fasiola gigantica, Paragonimus heterotremus, Teania saginata, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides thu thập từ người hoặc động vật, mỗi loài: 01 mẫu.
2.2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 2.2.3.1. Tách chiết ADN: 2.2.3.1. Tách chiết ADN:
Tách ADN tổng số từ mẫu phân:
Xử lý mẫu:
Các mẫu phân thu từ người dân bảo quản ở -200 được lấy ra đểtan đá. Cân khoảng180 - 220 mg phân vào ống nhựa 2 mL và rửa 2 lần bằng 1 mL dung dịch PBS 1X với tốc độ li tâm mẫu 8.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu phần cặn lắng sử dụng để tách ADN.
Tách ADN: ADN được tách chiết bằng bộ kít QIAamp DNA Stool Mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước cụ thể như sau:
- Thêm 1,4 mL dung dịch đệm ASL vào mỗi ống mẫu đã được xử lý. Trộn bằng máy vortex trong 1 phút cho đến khi hỗn hợp dung dịch đồng nhất. Ủ mẫu ở 950C trên máy lắc ủ nhiệt khơ với tốc độ lắc 1400 vịng/phút trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 3 phút, hút toàn bộ dịch nổi vào ống tube 2 mL mới và loại bỏ ống chứa cặn.
- Thêm 1 viên InhibitEX vào mỗi ống mẫu, trộn ngay lập tức và liên tục trong 1 phút cho đến khi viên InhibitEX tan hoàn toàn. Để ống mẫu 5 phút ở nhiệt
độ phòng. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vịng/phút trong 5 phút. Hút tồn bộ dịch nổi vào ống tube 1,5 ml mới và loại bỏ ống chứa cặn. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 3 phút.
- Thêm 25 µl proteinase K vào ống tube 2 ml mới, hút 600 µl dịch nổi thu được ở trên vào ống chứa proteinase , thêm 600 µl đệm AL và trộn bằng vortex trong 15 giây.
- Ủ mẫu 700
C trong 10 phút, ly tâm nhanh, thêm 600 µl Ethanol 96-100% và trộn mẫu bằng vortex.
- Hút 600 µl dung dịch trên vào ống chứa cột lọc. Ly tâm tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút. Tiếp tục hút 600 µl dung dịch trên vào ống chứa cột lọc. Ly tâm tốc độ 13.200 vịng/phút trong 1 phút. Hút tồn bộ dung dịch trên còn lại vào ống chứa cột lọc. Ly tâm tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút. - Đặt cột lọc vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống chứa dịch lọc.Thêm 500 µl đệm
AW1 vào ống cột lọc. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút.
- Đặt cột lọc vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống chứa dịch lọc.Thêm 500 µl đệm AW2 vào ống cột lọc. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 3 phút.
- Đặt cột lọc vào ống 1,5ml sạch, thêm 60 µl đệm AE vào chính giữa cột lọc, để ở nhiệt độ phịng 5 phút. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút.Bảo quản mẫu ADN ở -200C để sử dụng cho PCR và LAMP.
Tách ADN từ mẫu sán trƣởng thành:
Xử lý mẫu:
Lấy 01 con sán lá gan nhỏ được bảo quản trong cồn 70% và ở -200C vào ống Eppendorf 1,5 mL. Rửa sán 2 lần bằng 1 mL dung dịch PBS 1Xở tốc độ li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và thêm vào 20µL nước cất khử ion vào mẫu, dùng chầy nhựa sạch nghiền mẫu đến khi thành hỗn dịch đồng nhất.