Các trình tự được tải về và được phân tích so sánh gióng hàng bằng thuật toán ClustalW Multiple Alignment của phần mềm ioedit v.2.7.6 để xác định vùng bảo thủ. Vùng trình tự bảo thủ được sử dụng để thiết kế bộ mồi LAMP bằng phần mềm trực tuyến PrimerExproler V5.
Hình 3.2. Ảnh phân tích gióng h ng 24 trình tự gen nad1 của C. sinensis bằng phần mềm Bioedit v.2.6.7
3.1.1.2.Kết quả thiết kế mồi LAMP trên vùng bảo thủ trên gen đích nad1 và đánh giá độ đặc hiệu lý thuyết
Khác với kỹ thuật PCR, phản ứng LAMP cần tối thiểu 4 mồi gồm F3 (mồi xi ngồi), B3 (mồi ngược ngồi), FIP (mồi xuôi trong) và BIP (mồi ngược trong). Để tăng tốc độ phản ứng, người ta có thể dùng thêm các mồi bắt cặp với vùng vòm được gọi là LF (Loop forward hay mồi vịm xi) và LB (Loop backward hay mồi vịm ngược). Trong nghiên cứu này, chúng tơi thiết kế phản ứng LAMP với 4 mồi là F3, B3, FIP và BIP.
Sử dụng phần mềm PrimerExproler V5với vùng trình tự bảo tồn của gen
nad1 lựa chọn để thiết kế mồi LAMP. Các bộ mồi được lựa chọn theo một số tiêu
chí chính đã được khuyến cáo trong hướng dẫn sử dụng phần mềm PrimerExproler V5 bao gồm Tm của F1c và B1c khoảng 650C (64 – 660C); Tm của F2, B2, F3 và B3 khoảng 600C (59 – 610C). Yêu cầu về tỷ lệ GC trong mồi dao động từ 40% đến 65%. Mồi được lựa chọn phải ít có khả năng tạo cấu trúc bậc 2. Kiểm tra độ đặc hiệu lý thuyết của các mồi bằng công cụ Blast của NC I để đảm bảo các bộ mồi có
độ đặc hiệu cao với gen đích. Dựa vào các tiêu chí trên, 2 bộ mồi được lựa chọn (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Trình tự mồi LAMP đƣợc thiết kế để khuếch đại gen nad1
Tên mồi Trình tự (5’-3’) CS-Nad1-F3 CS-Nad1-B3 CS-Nad1-FIP CS-Nad1-BIP CTCATGATGGTGGGTGTG CCAAAGCGCATATTATAACAATG CAACCCTTAAAACCCTATAACCAGTTTTGTTCAGTGACGCTTTTGTG GTTGGGGGTCGTATAAAAAGTTTGTTTTAAAACAGGCCTCGAATGT TCS-Nad1-F3 TCS-Nad1-B3 TCS-Nad1-FIP TCS-Nad1-BIP GTTCAGTGACGCTTTTGTG GTAATCACCACACACCAAAG TATACGACCCCCAACCAACCTTTTGTTGCTTTTAATTACTAGGTTGAC AAGTTTGCTCTTATAAGTTGTGTGCTTTTAATGCACATAAAACAGGCC
Các bộ mồi được lựa chọn đều đáp ứng các tiêu chí về Tm đối với thiết kế mồi. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu lý thuyết của các mồi bằng công cụ Blast của NCBI cho thấy các bộ mồi đều bắt cặp đặc hiệu 100% với trình tự gen nad1 được
cơng bố trên NCBI và khơng lai chéo với trình tự của các lồi sinh vật khác. Chúng tôi sử dụng 2 bộ mồi này để sàng lọc, lựa chọn bộ mồi có độ nhạy cao hơn.
3.1.1.3. Kết quả lựa chọn và đánh giá độ đặc hiệu của mồi LAMP bằng thực nghiệm
Kết quả lựa chọn bộ mồi LAMP có độ nhạy tốt nhất:
Để lựa chọn được bộ mồi cho độ nhạy cao hơn và khơng lai chéo với lồi sán lá gan nhỏ khác ở Việt Nam là O. viverrini, chúng tôi đã thực hiện các phản ứng
LAMP với hai bộ mồi thiết kế, sử dụng mẫu ADN tổng số tách chiết từ con sán lá gan nhỏ trưởng thành C. sinensis, được pha loãng ở 3 nồng độ khác nhau 1 ng/µl, 100 pg/µl và 10 pg/µl và 01 mẫu ADN của O. viverrini. Đánh giá hiệu quả khuếch đại của các bộ mồi bằng điện di trên gel agarose 2% (Hình 3.3).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
CS-Nad1 TCS-Nad1
Hình 3.3. Ảnh điện di kết quả thử nghiệm các mồi LAMP thiết kế dựa trên khả năng tổng hợp ADN
1, 12: Ladder 100 bp
2, 7: ADN của O. viverrini(10 pg/µl)
3,4,5:ADN của C. sinensis với các nồng độ 1 ng/µl, 100 pg/µl và 10 pg/µl với bộ mồi CS-Nad1
6, 11: Chứng âm (nước khử ion)
8,9,10 ADN của C. sinensis với các nồng độ 1 ng/µl, 100 pg/µl và 10 pg/µl với bộ mồi TCS-Nad1
Kết quả thí nghiệm cho thấy bộ mồi CS-Nad1có độ nhạy cao hơn, cho sản phẩm khuếch đại ADNđối với sán lá gan nhỏC. sinensis ở cả 3 nồng độ mẫu thử nghiệm, bộ mồi TCS-Nad1 chỉ cho sản phẩm khuếch đại ở 2 nồng độ mẫu thử nghiệm. Hai bộ mồi đều khơng lai chéo với sán lá gan nhỏ lồi O. viverrini. Do vậy, bộ mồi CS-Nad1 được lựa chọn để tiếp tục khảo sát độ đặc hiệu bằng thực nghiệm.
Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của mồi F3/B3 bằng kỹ thuật PCR:
Sử dụng cặp mồi ngoài F3, B3 của bộ mồi LAMP thiết kế với ký hiệu CS- Nad1 để khảo sát độ đặc hiệu với C. sinensis. Thực hiện phản ứng PCR nhân bản vùng gen đích nad1 với mẫu ADNkhn được tách từ sán lá gan nhỏ C. sinensis