Kết quả xét nghiệm Số lƣợng Tỷ lệ % Dƣơng tính Trứng sán lá gan nhỏ 66 21,36 Trứng các loài giun, sán khác 22 7,12
Âm tính Khơng phát hiện trứng giun,
sán 221 71,52
Tổng 309 100
ằng kỹ thuật ato-Katz đã phát hiện được 66/309 người nhiễm trứng sán lá gan nhỏ với tỷ lệ nhiễm là 21,36%, kết quả này tương đồng với kết quả của một số kết quả điều tra gần đây được tiến hành bởi Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng trung ương [7], [10].
Trong 66 người nhiễm trứng sán lá gan nhỏ, có 5 người nhiễm trứng sán với cường độ cao được lựa chọn uống thuốc để tẩy, đãi thu sán lá gan nhỏ trưởng thành. ết quả tẩy sán thu được sán lá gan nhỏ trưởng thành ở 3/5 người ( ảng 3.4).
Bảng 3.4. Kết quả tẩy, đãi thu sán lá gan nhỏ C. sinensis STT Mã số Số sán lá gan nhỏ thu đƣợc (con)
1 NB0014T 31 2 NB0039T 19 3 NB0062T 0 4 NB0146T 1 5 NB0149T 0 Tổng 51
Các con sán trưởng thành được bảo quản trong cồn 700 và vận chuyển về phịng thí nghiệm để sử dụng cho nghiên cứu thiết lập quy trình và đánh giá, thử nghiệm khác.
3.2.2. Kết quả thiết lập bộ mẫu sử dụng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis
Đến nay, phát hiện trứng sán lá gan nhỏ trong phân được coi là chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh sán lá gan nhỏ. Tuy nhiên do cường độ nhiễm trứng trong phân thấp nên khi xét nghiệm bằng kỹ thuật Kato-Katz có thể bỏ sót các trường hợp
nhiễm trứng với cường độ thấp hoặc có thể do lượng trứng trong phân ít dẫn đến q trình tách AND đạt yêu cầu cho kỹ thuật real time PCR. Hơn nữa, do hình thái trứng sán lá gan nhỏ C. sinensis không thể phân biệt được với trứng của các loài sán lá gan nhỏ khác, dễ nhầm lẫn với trứng sán lá ruột nhỏ nên việc định loại chính xác trứng sán lá gan nhỏ cịn phụ thuộc vào trình độ và kinh nghiệm của kỹ thuật viên nên có thể có những trường hợp dương tính với Kato- atz nhưng âm tính với real time PCR [39].
Chúng tôi tiến hành xét nghiệm cho 100 mẫu phân thu thập từ đợt điều tra trong đó có 66 mẫu phân nhiễm trứng sán lá gan nhỏ C. sinensis và 34 mẫu phân không nhiễm trứng sán lá gan nhỏ bằng kỹ thuật real time PCR.Kết quả xét nghiệm cho thấy có 59/66 mẫu dương tính với sán lá gan nhỏ chiếm tỷ lệ 89,39%, có 7/66 mẫu dương tính với Kato- atz nhưng âm tính với real time PCR chiếm tỷ lệ (10,61%), 34/34 mẫu âm tính với cả 2 kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR.
Từ kết quả trên, chúng tôi thiết lập bộ 100 mẫu giả định sử dụng cho đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP trong đó có 73 mẫu dương tính và 27 mẫu âm tính với sán lá gan nhỏ bằng đồng thời cả 2 kỹ thuật Kato-Katz và Real time PCR từ mẫu phân sao cho có được tỷ lệ tương đối đồng đều ở các cường độ nhiễm trứng trong phân (Bảng 3.5).
Bảng 3.5Kết quả thiết lập bộ mẫu đểđánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP
Loại mẫu Số lƣợng
Mẫu phân nhiễm trứng sán lá gan nhỏ < 100 trứng/ 1gram phân 27 Mẫu phântrứng sán lá gan nhỏ từ 100 đến < 1000 trứng/ 1gram
phân 23
Mẫu phântrứng sán lá gan nhỏ> 1000 trứng/ 1gram phân 23
Mẫu phân không nhiễm trứng sán lá gan nhỏ 27
Tổng 100
3.2.3. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP phát hiện C. sinensis trên người C. sinensis trên người
3.2.3.1. Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình kỹ thuật LAMP trên bộ mẫu giả định
Thực hiện phản ứng LAMP xét nghiệm 100 mẫu giả định theo quy trình được thiết lập ở trên. Kết quả xác định được có 72/73 (98,63%) mẫu dương tính cho kết quả xét nghiệm LAMP dương tính, 28 mẫu cho kết quả xét nghiệm LAMP âm tính với sán lá gan nhỏ C. sinensis. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP so với kết quả tham chiếu bằng Kato- atz và real time PCR được trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis tại phịng thí nghiệm
Kato-Katz và real time
PCR Dương tính Âm tính Tổng Kỹ thuật LAMP Dương tính 72 0 72 Âm tính 1 27 28 Tổng 73 27 100
Sử dụng phần mềm Win episzcope 2.0, với độ tin cậy 95% để phân tích độ nhạy, độ đặc hiệu. Độ nhạy của kỹ thuật LAMP xác địnhC. sinensis khi đánh giá
trên các mẫu tham chiếu tại phịng thí nghiệm là 98,6%, độ đặc hiệu là 100%, giá trị tiên đoán dương là 100%, giá trị tiên đoán âm là 96,4%.
3.2.3.2. Kết quả khảo sát sự lai chéo của kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ với một số loài giun sán gây bệnh trên người
Thực hiện khảo sát trên 8 loài bao gồm O. viverrini, Haplorchis taichui, H.
pumilio; Fasiola gigantica, Paragonimus heterotremus, Teania saginata, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides. Kết quả xác định kỹ thuật LAMP
dương tính đặc hiệu với C. sinensis mà khơng lai chéo với các lồi giun, sán được thử nghiệm (Hình 3.16).
Hình 3.16.Kết quả khảo sát khả năng lai chéo của kỹ thuật LAMP với các lo i giun, sán gây bệnh trên ngƣời
Ống 1: Mẫu chứng âm; Ống 2: Sán lá gan nhỏ O. viverrini; Ống 3: Sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui; Ống 4: Sán lá gan nhỏ C. sinensis; Ống 5: Sán lá ruột nhỏ Haplorchis pumilo; Ống 6: Sán lá gan lớn F. gigantica; Ống 7: Sán lá phổi Paragonimus heterotremus; Ống 8: Sán dây Teania saginata; Ống 9: Giun móc Ancylostoma duodenale;
Ống 10: Giun đũa Ascaris lumbricoides; Ống 11: Chứng dương
Kết quả xét nghiệm cho thấy phản ứng LAMP đặc hiệu cho C.sinensis và khơng có sự lai chéo với các lồi giun sán khác.
hi so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP của nghiên cứu này với một số kết quả nghiên cứu trên thế giới gần đây thì thấy có sự tương đồng cao. Tuy sử dụng nguồn ADN từ nhiều nền mẫu khác nhau nhưng các kết quả nghiên cứu đều đánh giá LAMP có độ nhạy cao hơn PCR khoảng từ 100 đến 1000 lần [15], [31].
Nghiên cứu của Rahman và cs cho thấy LAMP phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ nhiễm trên mẫu phân người đạt độ nhạy là 100% với các mẫu nhiễm > 100 trứng/1 gram phân, đạt 93,1% với các mẫu nhiễm < 100 trứng/1 gram phân [39], nghiên cứu này cho độ nhạy 98,6%, do có sự sai khác kết quả ở 01 mẫu có cường độ nhiễm thấp < 100 trứng/ gram phân (Phụ lục 2). Trong các nghiên cứu đã báo cáo đều ghi nhận kỹ thuật LAMP đặc hiệu với sán lá gan nhỏ C. sinensis, không xảy ra hiện
tương lai chéo với một số loài sán, gium thường gặp nhiễm trên người [15], [18], [39].
Mặc dù độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP trong các báo cáo rất cao, tuy nhiên một số nghiên cứu cũng đưa ra những cảnh báo về nguy cơ tạp nhiễm trong quá trình thao tác kỹ thuật, do vậy việc tuân thủ quy trình xét nghiệm và sử dụng phương pháp phát hiện sản phẩm bằng chất nhuộm màu, hoặc huỳnh quang giúp hạn chế các nguy cơ tạp nhiễm [22].
KẾT LUẬN
1. Đã thiết lập thành cơng quy trình kỹ thuật LAMP chẩn đốn xác định nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người bao gồm thiết kế mồi LAMP đặc hiệu
với gen đíchnad1; đã tối ưu được các thành phần tham gia phản ứng LAMP với nồng độ 8,0 mM MgSO4, 1,4 mM dNTP mix, 0,2 µM mồi CS-Nad1-F3, 0,2 µM CS-Nad1-B3, 1,6 µM CS-Nad1-FIP, 1,6 µM CS-Nad1-BIP, 100 µM HNB, 4 µl ADN khn; điều kiện ủ của phản ứng LAMP là 630C, thời gian ủ
là 60 phút; giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP là 10-9 ng/µl ADN của
C. sinensis.
2. Quy trình kỹ thuật LAMP chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ
C. sinensis trên người có độ nhạy là 98,6%, độ đặc hiệu là 100%, giá trị tiên
đoán dương là 100%, giá trị tiên đoán âm là 96,4% khi đánh giá trên các mẫu giả định được thiết lập từ mẫu phân nhiễm trứng sán lá gan nhỏ tại phịng thí nghiệm. Quy trình LAMP khơng có sự lai chéo với 8 lồi giun sán khác bao gồm O. viverrini, Haplorchis taichui, H. pumilio; Fasiola gigantica, Paragonimus heterotremus, Teania saginata, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu phát triển quy trình kỹ thuật để chế tạo bộ kít LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ, ứng dụng trong cơng tác nghiên cứu, chẩn đốn và điều trị bệnh sán lá gan nhỏ cho người dân.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. ộ Y tế, (2004), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh sán lá gan nhỏ,
sán lá phổi, sán dây và bệnh ấu trùng sán lợn.
2. Nguyễn Văn Đề, P.V.T. (2012), Ký sinh trùng Y học. Giáo trình đào tạo
ác sỹ đa khoa, NX Y học, Hà Nội.
3. Lê Quang Huấn Hoàng Phú Hiệp (2011), " ỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) hướng đi mới trong việc tạo it phát hiện nhanh bệnh truyền nhiễm", Tạp chí khoa học và cơng nghệ, 90 (02), tr. 43-48.
4. Lê Quang Huấn Hoàng Phú Hiệp (2011), " ỹ thuật LAMP (Loop- mediated isothermal amplification) cho việc phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Escherichia coli O157:H7", Tạp chí sinh học 34 (03), tr. 343- 346.
5. Hồng TT, V.L. (2006), "Điều tra nhiễm Strongyloides stercoralis bằng
phương pháp cấy nghiệm phân cải tiến tại xã Phú Hịa Đơng, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 7/2006 đến tháng 12/2006",Y học
TP. Hồ Chí Minh,tr. 39-41.
6. Huỳnh Hồng Quang, (2018),"Nghiên cứu ứng dụng quan kỹ thuật LAMP
trong chẩn đoán và phát hiện các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm",
http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn.
7. Đặng Thị Cẩm Thạch, Đ.T.D. (2008), "Tình hình nhiễm sán lá trên người tại 2 xã Nghĩa Phú và Nghĩa Lạc, huyện Nghĩa Hưng , tỉnh Nam Định, 2007",Tạp chí Phịng chống bệnh Sốt rét và các bệnh Ký sinh trùng, 1,tr. 47-53.
8. Phạm Văn Trọng, ed. P.V.D.H. laus rickeberg, Nguyễn Văn Sơn (2014), Dịch tễ học chìa khóa của dự phịng,NX Y học, Hà Nội.
9. Viện Sốt rét –Ký sinh trùng- Côn trùng trung ương (2013), “Cẩm nang xét
nghiệm chẩn đoán giun sán”NXB Y học, Hà Nội.
10. Viện sốt rét - Ký sinh trùng- Côn trùng Trung ương (2015), áo cáo tổng
kết cơng tác phịng chống sốt rét, ký sinh trùng-côn trùng năm 2015 và triển khai kế hoạch năm 2016.
Tiếng Anh
11. Apt W, A.X., Vega F, Miranda C, Zulantay I, Perez C, Gabor M, Apt P. (1995), "Treatment of human chronic fascioliasis with triclabendazole:
drug efficacy and serologic response",The American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene, 52(6), pp. 532-535.
12. Bena G, J.M., Olivieri I I, Lejeune B (1998), "Ribosomal External and Internal Transcribed Spacers: Combined Use in the Phylogenetic Analysis of Medicago (Leguminosae)",Journal of Molecular Evolution, 46(3), pp. 299-306.
13. Bouvard V, B.R., Straif K, Grosse Y, Secretan B, El Ghissassi F, Benbrahim-Tallaa L, Guha N, Freeman C, Galichet L, Cogliano V; WHO International Agency for Research on Cancer Monograph Working Group (2009), "A review of human carcinogens--Part B: biological agents",The
Lancet Oncology, 10(4), pp. 321–322.
14. Cai XQ, X.M., Wang YH, Qiu DY, Liu GX, Lin A, Tang JD, Zhang RL, Zhu XQ (2010), "Sensitive and rapid detection of Clonorchis sinensis infection in fish by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)",Parasitology Research, 106(6), pp. 1379-1383.
15. Cai XQ, L.G., Song HQ, Wu CY, Zou FC, Yan HK, Yuan ZG, Lin RQ, Zhu XQ (2012), "Sequences and gene organization of the mitochondrial genomes of the liver flukes Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis (Trematoda)",Parasitology Research, 110(1), pp. 235-243.
16. Cai XQ, Y.H., Bai JS, Tang JD, Hu XC, Chen DH, Zhang RL, Chen MX, Ai L, Zhu XQ (2012), "Development of a TaqMan based real-time PCR assay for detection of Clonorchis sinensis DNA in human stool samples
and fishes",International Journal for Parasitology, 61(1), pp. 183-186. 17. Chen MX, A.L., Zhang RL, Xia JJ, Wang K, Chen SH, Zhang YN, Xu
MJ, Li X, Zhu XQ, Chen JX (2011), "Sensitive and rapid detection of
Paragonimus westermani infection in humans and animals by loop-
mediated isothermal amplification (LAMP)",Parasitology Research, 108(5), pp. 1193-1198.
18. Chen Y, W.T., Lai DH, Wen YZ, Wu ZD, Yang TB, Yu XB, Hide G, Lun ZR (2013), "Development and evaluation of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection of Clonorchis sinensis from its
first intermediate hosts, freshwater snails",Parasitology, 140(11), pp. 1377-1383.
19. Craw P, B.W. (2012), "Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review",Lab on a Chip, 12(14): pp. 2469-2486.
20. DR, H. (1992), "Homing in on helminths",The American Journal of
Tropical Medicine and Hygiene, 46(6), pp. 626-634.
21. Gab-Man Park, T.-S.Y., Kyung-il Im, Kyu-Je Lee (2000), "Isozyme electrophoresis patterns of the liver fluke, Clonorchis sinensis from
Kimhae, Korea and from Shenyang, China",The Korean Journal of
Parasitology, 38(1), pp. 45-48.
22. Goto M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. (2009), "Colorimetric detection of loopmediated mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue", BioTechniques.
46(3), pp. 167-172
23. H, Y. (1965), "The life cycle of Clonorchis sinensis: a comment on the
presentation in the seventh edition of Craig and Faust's Clinical Parasitology",Journal of Parasitology, 51(6): pp. 961-966.
24. Halliday KE, O.G., Turner EL, Njagi K, Mcharo C, Kengo J, Allen E, Dubeck MM, Jukes MC, Brooker SJ (2014), " Impact of intermittent screening and treatment for malaria among school children in Kenya: a cluster randomised trial",PLOS Medicine, 11(1): pp. e1001594.
25. Hassan MM, S.M., Hegab MH, Metwally S (2001), "Evaluation of circulating Fasciola antigens in specific diagnosis of fascioliasis",Journal
of the Egyptian Society of Parasitology, 31(1), pp. 271-279.
26. Hong ST, F.Y. (2012), "Clonorchis sinensis and clonorchiasis, an update",International Journal for Parasitology, 61(1), pp. 17-24.
27. Huang SY, T.J., Song HQ, Fu BQ, Xu MJ, Hu XC, Zhang H, Weng YB, Lin RQ, Zhu XQ (2012), "A specific PCR assay for the diagnosis of
Clonorchis sinensis infection in humans, cats and fishes",Parasitology International, 61(1), pp. 187-190.
28. Jitra Waikagul, U.T. (2014), Approaches to Research on the Systematics of Fish-Borne Trematodes. Academic Press.
29. Johnston, D.A., et al. (1993), "Small subunit (18S) ribosomal RNA gene divergence in the genus Schistosoma",Parasitology, 107 ( Pt 2): pp. 147- 56.
30. Komiya, Y. (1976), Clonorchis and Clonorchiasis. Advances in
Parasitology, ed. B. Dawes. Vol. 4. London: Academic Press.
31. Le TH, N.N., Truong NH, De NV. (2012), "Development of mitochondrial loop-mediated isothermal amplification for detection of the small liver fluke Opisthorchis viverrini (Opisthorchiidae; Trematoda;
Platyhelminthes)",Journal of Clinical Microbiology, 50(4), pp. 1178- 1184.
32. Lesage B, V.A., Emiliani S, Debaisieux L, Englert Y, Liesnard C (2006), "Development and evaluation of a qualitative reverse-transcriptase nested polymerase chain reaction protocol for same-day viral validation of human immunodeficiency virus type 1 ribonucleic acid in processed semen",Fertility and Sterility, 86(1), pp. 121-128.
33. Lun ZR, G.R., Lai DH, Li AX, Zhu XQ, Yu XB, Fang YY. (2005), "Clonorchiasis: a key foodborne zoonosis in China",The Lancet Infectious
Diseases, 5(1): pp. 31-41.
34. Mori Y, N.K., Tomita N, Notomi T (2001), "Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation",Biochemical and Biophysical Research
Communications, 289(1), pp. 150-154.
35. Müller B, S.J., Mehlhorn H (2007), "Sensitive and species-specific detection of Clonorchis sinensis by PCR in infected snails and
fishes",Parasitology Research, 100(4), pp. 911-914.
36. Nolan MJ, C.T. (2005), "The use and implications of ribosomal DNA sequencing for the discrimination of digenean species",Advances in
Parasitology, 60, pp. 101-163.
37. Notomi T, O.H., Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T (2000), "Loop-mediated isothermal amplification of DNA",Nucleic Acids Research, 28(12), pp. E63.
38. Parvathi, A., et al. (2007), "Clonorchis sinensis: development and evaluation of a nested polymerase chain reaction (PCR) assay",Exp
Parasitol, 115(3), pp. 291-5.
39. Rahman SMM, S.H., Jin Y, Oh JK, Lim MK, Hong ST, Choi MH (2017), "Application of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay
targeting cox1 gene for the detection of Clonorchis sinensis in human
fecal samples",PLOS Neglected Tropical Diseases, 11(10), pp. e0005995. 40. Rim Hl, L.S., Seo BS (1973), "Studies on the epidemiology and clinical
aspects on clonorchiasis in Korea",Mew Med J (Seoul) 16, pp. 81-91. 41. Shekhovtsov SV, K.A., Romanov KV, Besprozvannykh VV, Fedorov KP,
Yurlova NI, Serbina EA, Sithithaworn P, Kolchanov NA, Mordvinov VA (2009), "A novel nuclear marker, Pm-int9, for phylogenetic studies of
Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, and Clonorchis sinensis
(Opisthorchiidae, Trematoda)",Parasitology Research, 106(1), pp. 293-