1.4.1 .DNA ribosome(rDNA)trong hệ gen nhân
2.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung Ương.
- Địa điểm thu thập mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành: Xã Yên Lộc, huyện im Sơn, tỉnh Ninh Bình.
2.1.4. Hóa chất, vật tư tiêu hao, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
- Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1 và Bảng 2.2
Bảng 2.1. Các hóa chất, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Nguồn gốc
1 QIAamp DNA Stool mini Kit QIAGEN
2 Chelex-100 resin Sigma-Aldrich (Đức)
3 Ethanol tuyệt đối Sigma-Aldrich (Đức)
4 Primers (Bảng 2.2) IDT (Mỹ)
5 dNTPs Thermo Scientific
6 Hot Start DNA Taq polymerase (5 units/µl)
QIAGEN
(8.000 units/µl)
8 2X FastGen Probe NIPPON Genetics Europe
9 Nước khử ion Omega Biotek
10 TBE 10X Serva
11 Ladder 100 bp Norgen Biotek Corp
12 Agarose Serva
13 Dung dịch nhuộm Redsafe Intron-Korea
14 Các hóa chất giải trình tự gen Hãng ABI 15 HNB (Hydroxy naphthol blue) Sigma-Aldrich (Đức) 16 DNA tái tổ hợp mang gen nad1 của
C. sinensis ( nồng độ 1 ng/µl)
Viện Sốt rét – KST-CTTW
Bảng 2.2. Trình tự các bộ mồi sử dụng cho LAMP, real time PCR
TT Tên mồi Trình tự (5’ 3') I Trình tự các mồi LAMP 1 CS-Nad1-F3 CTCATGATGGTGGGTGTG 2 CS-Nad1-B3 CCAAAGCGCATATTATAACAATG 3 CS-Nad1-FIP CAACCCTTAAAACCCTATAACCAGTTTTGTTCA GTGACGCTTTTGTG 4 CS-Nad1-BIP GTTGGGGGTCGTATAAAAAGTTTGTTTTAAAAC AGGCCTCGAATGT 5 HCS-Nad1-F3 GTTCAGTGACGCTTTTGTG 6 HCS-Nad1-B3 GTAATCACCACACACCAAAG 7 HCS-Nad1-FIP TATACGACCCCCAACCAACCTTTTGTTGCTTTT AATTACTAGGTTGAC 8 HCS-Nad1-BIP AAGTTTGCTCTTATAAGTTGTGTGCTTTTAATGC ACATAAAACAGGCC
II Trình tự mồi sử dụng Real time PCR
1 CSFQ-F AGCGATTCTAGTTCCGTCATCTG
2 CSFQ-R AGGTATAGCCAGGAATTGGTAGAAC
Các vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.3
Bảng 2.3. Danh mục vật tƣ tiêu hao chính sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên vật tƣ, tiêu hao Nguồn gốc
1 Filter tip 0,1-10 µl AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 2 Filter tip 1-100 µl AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 3 Filter tip 1-200 µl AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 4 Filter tip 100-1000 µl AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 5 Ồng eppendorf 1,5 ml AHN Biotechnologie GmbH (Đức)
6 Ống nhựa 2 ml AHN Biotechnologie GmbH (Đức)
7 Ống Fancol 15 ml AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 8 Ống Fancol 50 ml AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 9 Ống PCR 0,2 ml AHN Biotechnologie GmbH (Đức) 10 Giấy paraffin AHN Biotechnologie GmbH (Đức)
11 Hộp lưu mẫu AHN Biotechnologie GmbH (Đức)
12 Găng tay không bột talc Malaysia
13 Khẩu trang y tế Việt Nam
14 Giấy lau Việt Nam
- Các máy, thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.4
Bảng 2.4. Danh mục máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Nguồn gốc
1 Máy ly tâm Eppendoft
2 Máy lắc, ủ nhiệt khô Eppendoft
3 Máy PCR Eppendoft
4 Máy real time PCR ABI 7500 ABI Thermor
5 Hệ thống điện di và chụp ảnh kỹ thuật số Geldoc 6 Hệ thống giải trình tự gen ABI 3500 ABI Thermo
7 Tủ an toàn sinh học cấp II Essco
8 Máy vortex I A (Đức)
9 Tủ sấy Sanyo
10 Tủ ấm Sanyo
11 Micropipet các loại điều chỉnh thể tích từ 0,1µl -1000 µl
Eppendorf
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật được thực hiện
theo sơ đồ sau:
9
Tối ưu các điều kiện của kỹ thuật LAMP, thiết lập
quy trình kỹ thuật LAMP 1. Nhiệt độ ủ 2. Thời gian phản ứng 3. Nồng độ Mg+ 4. Nồng độ mồi 5. Nồng độ dNTP
6. Lượng DNA đưa vào phản ứng
7. Chất chỉ thị mầu HNB 8. Ngưỡng phát hiện của phản ứng
Tách ADN tổng số Thu mẫu phân, mẫu sán
lá gan nhỏ C. sinensis trưởng thành
Thiết kế mồi LAMP
Khảo sát tính đặc hiệu, lựa chọn bộ mồi thiết kế
bằng PCR, giải trình tự gen, LAMP
Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật
LAMP xác định
2.2.1.1. Thu thập mẫu phân, mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành
Tiến hành điều tra cắt ngang thu mẫu phân để xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ trên người bằng kỹ thuật Kato-Katz tại xã Yên Lộc, huyện im Sơn, tỉnh Ninh ình. Đối tượng lựa chọn là người dân sống tại địa phương, từ 18 tuổi trở lên, từng ăn gỏi cá, có một số biểu hiện lâm sàng như đau bụng, mệt mỏi, chán ăn, rối loạn tiêu hóa, khó tiêu và tự nguyện tham gia nghiên cứu.
Những bệnh nhân có cường độ nhiễm trứng trong phân > 1000 trứng/ gram phân được lựa chọn tẩy sán thu con sán trưởng thành.
Tổng số mẫu đã thu thập: 309 mẫu phân, 51 con sán trưởng thành.
2.2.1.2. Tách ADN tổng số
Tách ADN tổng số từ mẫu phân sử dụng bộ kít Qiagen DNA stool mini kit. Tách ADN từ con sán trưởng thành bằng phương pháp chelex 100-10%.
2.2.1.3. Thiết kế mồi LAMP
Tìm kiếm trình tự gen đích là gen ty thể nad1 của C. sinensis trên NCBI,
khảo sát lựa chọn vùng bảo thủ, thiết kế các bộ mồi LAMP sử dụng phần mềm Primer Explorer v.5 (https://primerexplorer.jp/e/). Kiểm tra tính đặc hiệu lý thuyết của mồi bằng Primer Blast trình tự mồi trên Genbank.
2.2.1.4. Lựa chọn bộ mồi LAMP, khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi thiết kế
Tiến hành khảo nghiệm các bộ mồi thiết kế bằng kỹ thuật LAMP với thành phần và điều kiện phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất enzym Bst DNA
Polymerase. Lựa chọn bộ mồi có độ nhạy cao hơn để khảo sát tính đặc hiệu mồi.
Khảo sát tính đặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm PCR và giải trình tự sản phẩm PCR.
+ Thí nghiệm thứ nhất: Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi F3 và 3 được thiết
kế để nhân bản vùng gen đích, sản phẩm PCR được giải trình tự để thẩm định kết quả đúng là trình tự của lồi sán lá gan nhỏ so với các trình tự chuẩn được cơng bố trên ngân hàng gen và đồng thời tìm kiếm trình tự tương đồng bằng chương trình last trên NC I để rút ra kết luận về tính đặc hiệu của sản phẩm PCR thu được.
+ Thí nghiệm thứ hai: Khảo sát sự bắt cặp chéo giữa mồi thiết kế cho C. sinensis với một số loài ký sinh trùng đường ruột khác như sán lá ruột
Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, sán lá gan lớn trưởng thành Fasciola gigantica, giun đũa….
2.2.1.5. Khảo sát tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP, thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người.
Tiến hành khảo sát tối ưu các điều kiện của kỹ thuật LAMP. Các yếu tố cần tối ưu bao gồm: Nhiệt độ và thời gian phản ứng, nồng độ mồi, nồng độ MgCl2 chất hiện màu phát hiện sản phẩm của phản ứng LAMP....
Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật dựa trên dãy nồng độ dãy pha lỗng chứng dương.
Viết quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người
2.2.1.6. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệucủa kỹ thuật LAMP xác định sán lá gan nhỏ C. sinensis trên người.
Với mong muốn quy trình kỹ thuật LAMP đạt được độ nhạy ≥ 95%, độ đặc hiệu ≥ 95%, tính tốn cỡ mẫu cần có để thử nghiệm theo cơng thức sau:
+ Ước lượng số mẫu dương tính để đánh giá độ nhạy cần có:
(Nse) = TP+FN = [Z21-α Pse (1- Pse)/W2]/P = [(1,96)2 (0,95 x 0,05)]/(0,1)2/0,25 = 73 mẫu
+ Ước lượng số mẫu âm tính để đánh giá độ đặc hiệu (Nsp) được xác định bằng công thức:
Nsp = TN+FP = [Z21-α Psp (1- Psp)/W2]/(1-P) = [(1,96)2 (0,95 x 0,05)/(0,1)2]/0,75 =24,33 mẫu
Trong đó:
Độ nhạy mong đợi của kỹ thuật LAMP (Pse): 95% Độ đặc hiệu mong đợi củakỹ thuật LAMP (Psp): 95%
Sai số ước tính của hai xác suất Pse và Psp (W): 10% Độ tin cậy (giá trị α = 0,05): 95%
Tỷ lệ (P) dương tính với sán lá gan nhỏ ở người dân có nguy cơ nhiễm cao ước tính khoảng 25% [7].
TP: Dương tính thật (true positives) FP: Dương tính giả (fasle positives) TN: Âm tính thật (true negatives) FN: Âm tính giả (false negatives)
Mẫu được xác định là dương tính khi có kết quả xét nghiệm dương tính đồng thời bằng cả 2 kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR.
Mẫu được xác định âm tính khi có kết quả xét nghiệm âm tính đồng thời bằng cả 2 kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR.
Từ kết quả tính được ở trên, nghiên cứu lựa chọn 100 mẫu trong đó 73 mẫu dương, 27 mẫu âm tính với C. sinensis để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu.
Các bƣớc tiến hành lựa chọn mẫu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu nhƣ sau:
+ Chọn chủ đích 100 mẫu phân được thu thập từ thực địabao gồm toàn bộ các mẫu phân dương tính và cịn lại là các mẫu phân âm tính với xét nghiệm Kato-Katz để thực hiện xét nghiệm bằng kỹ thuật real time PCR.
+ Các mẫu phân dương tính, âm tính đồng thời bằng hai kỹ thuật Kato-Katz và real time PCR được lựa chọn để thiết lập bộ mẫu 100 mẫu gồm có 73 mẫu dương, 27 mẫu âm tính với C. sinensis để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu. - Đánh giá khả năng lai chéo của kỹ thuật LAMP với các loài sán, giun khác:
Sử dụng các loài sán, giun khác để thử nghiệm gồm: O. viverrini, Haplorchis
taichui, H. pumilio; Fasiola gigantica, Paragonimus heterotremus, Teania saginata, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides thu thập từ người hoặc động vật, mỗi loài: 01 mẫu.
2.2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 2.2.3.1. Tách chiết ADN: 2.2.3.1. Tách chiết ADN:
Tách ADN tổng số từ mẫu phân:
Xử lý mẫu:
Các mẫu phân thu từ người dân bảo quản ở -200 được lấy ra đểtan đá. Cân khoảng180 - 220 mg phân vào ống nhựa 2 mL và rửa 2 lần bằng 1 mL dung dịch PBS 1X với tốc độ li tâm mẫu 8.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu phần cặn lắng sử dụng để tách ADN.
Tách ADN: ADN được tách chiết bằng bộ kít QIAamp DNA Stool Mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước cụ thể như sau:
- Thêm 1,4 mL dung dịch đệm ASL vào mỗi ống mẫu đã được xử lý. Trộn bằng máy vortex trong 1 phút cho đến khi hỗn hợp dung dịch đồng nhất. Ủ mẫu ở 950C trên máy lắc ủ nhiệt khơ với tốc độ lắc 1400 vịng/phút trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 3 phút, hút toàn bộ dịch nổi vào ống tube 2 mL mới và loại bỏ ống chứa cặn.
- Thêm 1 viên InhibitEX vào mỗi ống mẫu, trộn ngay lập tức và liên tục trong 1 phút cho đến khi viên InhibitEX tan hoàn toàn. Để ống mẫu 5 phút ở nhiệt
độ phòng. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vịng/phút trong 5 phút. Hút tồn bộ dịch nổi vào ống tube 1,5 ml mới và loại bỏ ống chứa cặn. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 3 phút.
- Thêm 25 µl proteinase K vào ống tube 2 ml mới, hút 600 µl dịch nổi thu được ở trên vào ống chứa proteinase , thêm 600 µl đệm AL và trộn bằng vortex trong 15 giây.
- Ủ mẫu 700
C trong 10 phút, ly tâm nhanh, thêm 600 µl Ethanol 96-100% và trộn mẫu bằng vortex.
- Hút 600 µl dung dịch trên vào ống chứa cột lọc. Ly tâm tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút. Tiếp tục hút 600 µl dung dịch trên vào ống chứa cột lọc. Ly tâm tốc độ 13.200 vịng/phút trong 1 phút. Hút tồn bộ dung dịch trên còn lại vào ống chứa cột lọc. Ly tâm tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút. - Đặt cột lọc vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống chứa dịch lọc.Thêm 500 µl đệm
AW1 vào ống cột lọc. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút.
- Đặt cột lọc vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống chứa dịch lọc.Thêm 500 µl đệm AW2 vào ống cột lọc. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 3 phút.
- Đặt cột lọc vào ống 1,5ml sạch, thêm 60 µl đệm AE vào chính giữa cột lọc, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút.Bảo quản mẫu ADN ở -200C để sử dụng cho PCR và LAMP.
Tách ADN từ mẫu sán trƣởng thành:
Xử lý mẫu:
Lấy 01 con sán lá gan nhỏ được bảo quản trong cồn 70% và ở -200C vào ống Eppendorf 1,5 mL. Rửa sán 2 lần bằng 1 mL dung dịch PBS 1Xở tốc độ li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và thêm vào 20µL nước cất khử ion vào mẫu, dùng chầy nhựa sạch nghiền mẫu đến khi thành hỗn dịch đồng nhất.
Thực hiện tách ADN: ADN được tách chiết bằng phương pháp sử dụng Chelex 100 - 10%. Các bước thực hiện như sau:
- Thêm 20 µL proteinase K vào mỗi ống mẫu, trộn đều mẫu trên máy lắc vortex, ủ mẫu trên máy lắc ủ nhiệt khô ở 560C, tốc độ lắc 900 vòng/phút trong 60 phút.
- Thêm 1 mL dung dịch PBS pha trong 1% saponin, trộn đều mẫu trên máy lắc vortex, để ống mẫu ở nhiệt độ phòng 20 phút. Ly tâm ống mẫu với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Hút 1 mL dung dịch PBS cho vào ống mẫu, trộn đều mẫu trên máy lắc vortex, ly tâm ống mẫu với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ hoàn toàn dịch nổi hút dịch nổi sang 1 ống mới.
- Thêm vào 100 µL dung dịch chelex-100 10%. Ủ mẫu trên máy lắc nhiệt ở 990C, tốc độ lắc 900 vòng/phút/10 phút. Ly tâm ống mẫu với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút dịch nổi vào ống Eppendorf 1,5 mL sạch, bảo quản ở -20 độ để sử dụng cho PCR và LAMP.
2.2.3.2. Kỹ thuật PCR
Thực hiện kỹ thuật PCR với cặp mồi F3/B3 của bộ mồi LAMP để khảo sát độ đặc hiệu của mồi thiết kế trên các mẫu ADN tách từ sán lá gan nhỏ C. sinensis trưởng thành thu thập từ người bệnh và các loài giun sán khác. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR như sau:
Thành phần phản ứng PCR trong tổng thể tích 25 µl gồm:
dNTPs (2,5 mM): 2,5 µl
10X PCR buffers: 2,5 µl
Mồi CS-Nad1-F3/B3 (2,5 µM): 2,5 µl Hot start Taq DNA polymerase: 0,25 µl
ADN khn: 5 µl
Nước khử ion: 12,25 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 950 C trong 15 phút, 35 chu kỳ phản ứng gồm 950C 30 giây, 580C trong 1 phút, 720C trong 1 phút 30 giây; 720C trong 10 phút, giữ mẫu ở 150C.
2.2.3.3. Kỹ thuật Kato-Katz
Thực hiện theo Quy trình chuẩn của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương [9]. Các bước chính của kỹ thuật như sau:
Lấy khoảng 5 gram phân đựng vào lọ sạch có nhãn
Dùng que lấy khoảng 100 mg phân (bằng hạt ngô) đặt lên giấy báo hoặc giấy thấm.
Đặt lưới lọc lên trên phân.
Dùng que ấn nhẹ cho phân lọt qua lưới lọc rồi gạt lấy phân phía trên.
Đặt phiến đong phân lên lam kính rồi lấy phân từ que gạt phân cho đầy vào lỗ đong.
Gạt nhẹ trên miệng hố để loại phần phân thừa, cẩn thận nhấc phiến đong ra, để lại phân đã đong trên lam kính.
Đặt mảnh cellophane lên trên phân. Dùng nút cao su hoặc lam kính khác ấn nhẹ cho phân dàn đều ra đến rìa của mảnh cellophane.
Để tiêu bản từ 15 phút - 60 phút đến khi trong và khô.
Soi phát hiện trứng sán bằng kính hiển vi với vật kính 10X, thị kính 10X. Chuyển sang vật kính 40X để xác định lồi, đếm trứng trong tồn bộ tiêu bản.
2.2.3.4. Kỹ thuật real time PCR sử dụng Taqman Probe
Thực hiện theo quy trình theo phương pháp của Cai X.Q và cs 2012 [16]. Thành phần của phản ứng real time PCR trong tổng thể tích 20 µl gồm:
2X Fastgen Probe: 10 µl CSFQ-F (10 µM) 0,4 µl CSFQ-R (10 µM) 0,4 µl Probe (10 µM) 0,2 µl ADN khn 2,0 µl Nước khử ion 7,0 µl
Chu trình nhiệt: 950C 5 phút, 45 chu kỳ của 950C trong 15 giây, 600C trong 40 giây.
2.2.3.5. Kỹ thuật LAMP
ước đầu thực hiện kỹ thuật LAMP theo thành phần và điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme st DNA polymerase, Large Fragment để tối ưu quy trình. Sau khi tối ưu quy trình kỹ thuật LAMP thì được sử dụng để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu của kỹ thuật.
Thành phần và điều kiện cơ bản của kỹ thuật LAMP trong tổng thể tích 25 µl: 10X ThermoPol Buffers: 2,5 µl (1X chứa 2mM MgSO4)