1.4.1 .DNA ribosome(rDNA)trong hệ gen nhân
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.2.3.1. Tách chiết ADN:
Tách ADN tổng số từ mẫu phân:
Xử lý mẫu:
Các mẫu phân thu từ người dân bảo quản ở -200 được lấy ra đểtan đá. Cân khoảng180 - 220 mg phân vào ống nhựa 2 mL và rửa 2 lần bằng 1 mL dung dịch PBS 1X với tốc độ li tâm mẫu 8.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu phần cặn lắng sử dụng để tách ADN.
Tách ADN: ADN được tách chiết bằng bộ kít QIAamp DNA Stool Mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước cụ thể như sau:
- Thêm 1,4 mL dung dịch đệm ASL vào mỗi ống mẫu đã được xử lý. Trộn bằng máy vortex trong 1 phút cho đến khi hỗn hợp dung dịch đồng nhất. Ủ mẫu ở 950C trên máy lắc ủ nhiệt khơ với tốc độ lắc 1400 vịng/phút trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vịng/phút trong 3 phút, hút tồn bộ dịch nổi vào ống tube 2 mL mới và loại bỏ ống chứa cặn.
- Thêm 1 viên InhibitEX vào mỗi ống mẫu, trộn ngay lập tức và liên tục trong 1 phút cho đến khi viên InhibitEX tan hoàn toàn. Để ống mẫu 5 phút ở nhiệt
độ phòng. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vịng/phút trong 5 phút. Hút tồn bộ dịch nổi vào ống tube 1,5 ml mới và loại bỏ ống chứa cặn. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 3 phút.
- Thêm 25 µl proteinase K vào ống tube 2 ml mới, hút 600 µl dịch nổi thu được ở trên vào ống chứa proteinase , thêm 600 µl đệm AL và trộn bằng vortex trong 15 giây.
- Ủ mẫu 700
C trong 10 phút, ly tâm nhanh, thêm 600 µl Ethanol 96-100% và trộn mẫu bằng vortex.
- Hút 600 µl dung dịch trên vào ống chứa cột lọc. Ly tâm tốc độ 13.200 vịng/phút trong 1 phút. Tiếp tục hút 600 µl dung dịch trên vào ống chứa cột lọc. Ly tâm tốc độ 13.200 vịng/phút trong 1 phút. Hút tồn bộ dung dịch trên còn lại vào ống chứa cột lọc. Ly tâm tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút. - Đặt cột lọc vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống chứa dịch lọc.Thêm 500 µl đệm
AW1 vào ống cột lọc. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút.
- Đặt cột lọc vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống chứa dịch lọc.Thêm 500 µl đệm AW2 vào ống cột lọc. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 3 phút.
- Đặt cột lọc vào ống 1,5ml sạch, thêm 60 µl đệm AE vào chính giữa cột lọc, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm ống mẫu ở tốc độ 13.200 vòng/phút trong 1 phút.Bảo quản mẫu ADN ở -200C để sử dụng cho PCR và LAMP.
Tách ADN từ mẫu sán trƣởng thành:
Xử lý mẫu:
Lấy 01 con sán lá gan nhỏ được bảo quản trong cồn 70% và ở -200C vào ống Eppendorf 1,5 mL. Rửa sán 2 lần bằng 1 mL dung dịch PBS 1Xở tốc độ li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và thêm vào 20µL nước cất khử ion vào mẫu, dùng chầy nhựa sạch nghiền mẫu đến khi thành hỗn dịch đồng nhất.
Thực hiện tách ADN: ADN được tách chiết bằng phương pháp sử dụng Chelex 100 - 10%. Các bước thực hiện như sau:
- Thêm 20 µL proteinase K vào mỗi ống mẫu, trộn đều mẫu trên máy lắc vortex, ủ mẫu trên máy lắc ủ nhiệt khô ở 560C, tốc độ lắc 900 vòng/phút trong 60 phút.
- Thêm 1 mL dung dịch PBS pha trong 1% saponin, trộn đều mẫu trên máy lắc vortex, để ống mẫu ở nhiệt độ phòng 20 phút. Ly tâm ống mẫu với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Hút 1 mL dung dịch PBS cho vào ống mẫu, trộn đều mẫu trên máy lắc vortex, ly tâm ống mẫu với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ hoàn toàn dịch nổi hút dịch nổi sang 1 ống mới.
- Thêm vào 100 µL dung dịch chelex-100 10%. Ủ mẫu trên máy lắc nhiệt ở 990C, tốc độ lắc 900 vòng/phút/10 phút. Ly tâm ống mẫu với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút dịch nổi vào ống Eppendorf 1,5 mL sạch, bảo quản ở -20 độ để sử dụng cho PCR và LAMP.
2.2.3.2. Kỹ thuật PCR
Thực hiện kỹ thuật PCR với cặp mồi F3/B3 của bộ mồi LAMP để khảo sát độ đặc hiệu của mồi thiết kế trên các mẫu ADN tách từ sán lá gan nhỏ C. sinensis trưởng thành thu thập từ người bệnh và các loài giun sán khác. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR như sau:
Thành phần phản ứng PCR trong tổng thể tích 25 µl gồm:
dNTPs (2,5 mM): 2,5 µl
10X PCR buffers: 2,5 µl
Mồi CS-Nad1-F3/B3 (2,5 µM): 2,5 µl Hot start Taq DNA polymerase: 0,25 µl
ADN khn: 5 µl
Nước khử ion: 12,25 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 950 C trong 15 phút, 35 chu kỳ phản ứng gồm 950C 30 giây, 580C trong 1 phút, 720C trong 1 phút 30 giây; 720C trong 10 phút, giữ mẫu ở 150C.
2.2.3.3. Kỹ thuật Kato-Katz
Thực hiện theo Quy trình chuẩn của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương [9]. Các bước chính của kỹ thuật như sau:
Lấy khoảng 5 gram phân đựng vào lọ sạch có nhãn
Dùng que lấy khoảng 100 mg phân (bằng hạt ngô) đặt lên giấy báo hoặc giấy thấm.
Đặt lưới lọc lên trên phân.
Dùng que ấn nhẹ cho phân lọt qua lưới lọc rồi gạt lấy phân phía trên.
Đặt phiến đong phân lên lam kính rồi lấy phân từ que gạt phân cho đầy vào lỗ đong.
Gạt nhẹ trên miệng hố để loại phần phân thừa, cẩn thận nhấc phiến đong ra, để lại phân đã đong trên lam kính.
Đặt mảnh cellophane lên trên phân. Dùng nút cao su hoặc lam kính khác ấn nhẹ cho phân dàn đều ra đến rìa của mảnh cellophane.
Để tiêu bản từ 15 phút - 60 phút đến khi trong và khô.
Soi phát hiện trứng sán bằng kính hiển vi với vật kính 10X, thị kính 10X. Chuyển sang vật kính 40X để xác định lồi, đếm trứng trong tồn bộ tiêu bản.
2.2.3.4. Kỹ thuật real time PCR sử dụng Taqman Probe
Thực hiện theo quy trình theo phương pháp của Cai X.Q và cs 2012 [16]. Thành phần của phản ứng real time PCR trong tổng thể tích 20 µl gồm:
2X Fastgen Probe: 10 µl CSFQ-F (10 µM) 0,4 µl CSFQ-R (10 µM) 0,4 µl Probe (10 µM) 0,2 µl ADN khn 2,0 µl Nước khử ion 7,0 µl
Chu trình nhiệt: 950C 5 phút, 45 chu kỳ của 950C trong 15 giây, 600C trong 40 giây.
2.2.3.5. Kỹ thuật LAMP
ước đầu thực hiện kỹ thuật LAMP theo thành phần và điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme st DNA polymerase, Large Fragment để tối ưu quy trình. Sau khi tối ưu quy trình kỹ thuật LAMP thì được sử dụng để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu của kỹ thuật.
Thành phần và điều kiện cơ bản của kỹ thuật LAMP trong tổng thể tích 25 µl: 10X ThermoPol Buffers: 2,5 µl (1X chứa 2mM MgSO4)
MgSO4 (100 mM): 1,5 µl (6mM) dNTP Mix (10 mM): 3,5 µl (1,4 mM) Mồi F3/B3 (5 µM) 2,5 µl (02 µM) Mồi FIP/BIP (40 µM) 2,5 µl (1,6 µM) Bst DNA polymerase 1,0 µl (320 U/ml)
ADN khn 2,0 µl
Nước khử ion: 9,5 µl
Điều kiện nhiệt độ của phản ứng: 650
C trong 60 phút, 800C trong 5 phút.
2.2.4.6. Kỹ thuật điện di
Sản phẩm PCR, LAMP được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm redsafe trong môi trường dung dịch TBE 1X. Kết quả được chụp ảnh trên hệ thống chụp ảnh gen Gel doc.