A. Dung dịch chuẩn trung gian
Nồng độ TCS TCC IS 100 ppm 100 µL std TCS 1000 ppm + 900 µL ACN 100 µL std TCC 1000 ppm + 900 µL ACN - 10 ppm 100 µL std TCS 100 ppm + 900 µL ACN 100 µL std TCC 100 ppm + 900 µL ACN - 1 ppm 100 µL std TCS 10 ppm + 900 µL ACN 100 µL std TCC 10 ppm + 900 µL ACN 100 µL std IS 10 ppm + 900 µL ACN 100 ppb 100 µL std TCS 1 ppm + 900 µL ACN 100 µL std TCC 1 ppm + 900 µL ACN 100 µL std IS 1 ppm + 900 µL ACN 10 ppb - 100 µL std TCC 100 ppb + 900 µL ACN -
B. Dung dịch chuẩn để dựng đƣờng chuẩn Điểm
chuẩn
Nồng độ
điểm chuẩn TCS TCC IS ACN
1 TCS: 10 ppb TCC: 1 ppb IS: 20 ppb 100 µL TCS 100 ppb 100 µL TCC 10 ppb 200 µL IS 100 ppb 600 µL 2 TCS: 50 ppb TCC: 5 ppb IS: 20 ppb 50 µL TCS 1 ppm 50 µL TCC 100 ppb 200 µL IS 100 ppb 700 µL 3 TCS: 100 ppb TCC: 10 ppb IS: 20 ppb 100 µL TCS 1 ppm 100 µL TCC 100 ppb 200 µL IS 100 ppb 600 µL 4 TCS: 200 ppb TCC: 20 ppb IS: 20 ppb 200 µL TCS 1 ppm 200 µL TCC 100 ppb 200 µL IS 100 ppb 400 µL
5 TCS: 500 ppb TCC: 50 ppb IS: 20 ppb 50 µL TCS 10 ppm 50 µL TCC 1 ppm 200 µL IS 100 ppb 700 µL 6 TCS: 1000 ppb TCC: 100 ppb IS: 20 ppb 100 µL TCS 10 ppm 100 µL TCC 1 ppm 200 µL IS 100 ppb 600 µL 7 TCS: 5000 ppb TCC: 500 ppb IS: 20 ppb 50 µL TCS 100ppm 50 µL TCC 10 ppm 200 µL IS 100 ppb 700 µL
2.2. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu 2.2.1. Chỉ tiêu phân tích 2.2.1. Chỉ tiêu phân tích
Luận văn này nghiên cứu quy trình phân tích triclosan và triclocarban. Đây là 2 trong số các chất đƣợc sử dụng phổ biến trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân... đang đƣợc quan tâm bởi độc tính của chúng đối với mơi trƣờng và sinh vật. Triclosan và triclocarban đã bị cấm sử dụng trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân tại một số Quốc gia.
2.2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng mẫu đƣợc nghiên cứu trong luận văn này là mẫu bụi trong nhà. Đây là một trong những dạng mẫu đặc trƣng cho môi trƣờng tiếp nhận triclosan và triclocarban. Mẫu bụi đƣợc dự đoán hàm lƣợng triclosan và triclocarban khá nhỏ (cỡ ppb). Việc làm sạch mẫu bụi cũng gặp nhiều khó khăn do bụi cịn hấp phụ nhiều chất dễ bay hơi khác trong khơng khí nên nền mẫu rất phức tạp. Khơng khí trong nhà là nơi có chứa nhiều đồ dùng nhƣ: đồ nội thất, mỹ phẩm, sản phẩm chăm sóc sức khỏe, do đó nguy cơ ơ nhiễm bởi TCS, TCC trong bụi là rất cao bởi chúng có phát tán vào khơng khí bằng con đƣờng bay hơi trong q trình sử dụng. Sau đó, TCS và TCC đƣợc phân bố vào bụi, nhất là trong các khu vực gần nhà tắm, phịng ngủ. Kích thƣớc hạt bụi càng nhỏ thì khả năng phân bố của TCS và TCC vào bụi càng lớn.
2.2.3. Nội dung nghiên cứu
Xây dựng phương pháp
Tiến hành nghiên cứu quy trình phân tích triclosan và triclocarban từ mẫu bụi trong nhà bao gồm:
Nghiên cứu điều kiện lấy mẫu, tách chiết, làm sạch và làm giàu mẫu từ các đối tƣợng nghiên cứu.
Lựa chọn thông số tối ƣu trên thiết bị LC-MS/MS. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp:
o Tính đặc hiệu, chọn lọc
o Xác định giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ.
o Xây dựng khoảng tuyến tính của nồng độ, lập đƣờng chuẩn và phƣơng trình hồi quy của đƣờng chuẩn.
o Xác nhận độ chính xác của phƣơng pháp.
Áp dụng phương pháp
Áp dụng phƣơng pháp đã nghiên cứu để khảo sát một số mẫu bụi trong nhà thu thập trên địa bàn Hà Nội và các địa phƣơng lân cận.
Ứng dụng tập số liệu phân tích để đánh giá mức độ phát thải
Từ kết quả phân tích mẫu bụi trong nhà, tập số liệu phân tích đƣợc đƣa ra để đánh giá mức độ phát thải của triclosan và triclocarban trong môi trƣờng, đồng thời đƣa ra những khuyến nghị mức độ rủi ro của chúng.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu và thực nghiệm
2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu, bảo quản mẫu và thơng tin mẫu phân tích
2.3.1.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu bụi đƣợc lấy bằng cách sử dụng máy hút bụi hoặc quét bởi chổi lông 10cm. Mẫu đƣợc lấy chủ yếu là bụi bám trên sàn nhà, nóc tủ, gầm giƣờng... Tại mỗi địa điểm (phịng) chúng tơi lấy một mẫu gộp để đánh giá hàm lƣợng TCS và TCC trung bình. Bụi bị giữ lại trong túi lọc của máy hút bụi hoặc quét thu thập vào phoi nhôm sạch, đƣợc dàn mỏng trên khay inox, dùng nhíp nhặt bỏ các mảnh vật liệu có kích thƣớc lớn nhƣ kim loại, giấy, nhựa, tóc,… rồi trộn đều. Mỗi mẫu bụi đƣợc lấy
5 - 10 gam, gói trong phoi nhơm sạch và chuyển vào túi PE kín. Tại phịng thí nghiệm, bụi đƣợc bảo quản ở nhiệt độ thƣờng trong chỗ tối đến khi phân tích.
2.3.1.2. Thơng tin mẫu phân tích
Mẫu phân tích đƣợc thu thập tại các hộ gia đình trong khu vực Hà Nội và lân cận. Các mẫu có thể đƣợc lấy tại các phịng khác nhau có thể trong cùng một hộ gia đình, đƣợc thu gom bởi hình thức khác nhau (máy hút bụi hoặc qt). Thơng tin cơ bản về các mẫu bụi chúng tôi thu thập đƣợc đƣa ra trong Bảng 2.3 sau đây:
Bảng 2.3. Thông tin mẫu bụi được khảo sát
TT Kí hiệu mẫu
Địa điểm lấy
mẫu Thông tin mẫu
1 Sample 1 Kí túc xá ĐH Hà Nội
Mẫu bụi trong phịng tập thể, diện tích 30m2, có phịng vệ sinh khép kín …
2 Sample 2 Xuân Thủy -
Cầu Giấy Mẫu bụi trong văn phịng cơng ty
3 Sample 3 Làng sinh viên Hacinco
Mẫu bụi trong phịng tập thể, diện tích 30m2, có phịng vệ sinh khép kín
4 Sample 4 Triều Khúc - Thanh Xuân
Mẫu bụi trong phòng thờ, diện tích 15m2
5 Sample 5 Thạch Thất - Hà Nội
Mẫu bụi trong phòng khách, diện tích 30m2
6 Sample 6 Kí túc xá ĐH KHTN
Mẫu bụi trong phịng tập thể, diện tích 25m2, có phịng vệ sinh khép kín
7 Sample 7 Kim Giang Mẫu bụi trong phịng ngủ, diện tích 15m2, phịng khép kín
8 Sample 8
Phịng 502 nhà D- Viện Cơng nghiệp
thực phẩm
Mẫu bụi tại phịng Staff, diện tích 35m2
9 Sample 9 Thạch Thất
10 Sample 10 Thạch Thất -
Hà Nội Mẫu bụi trong phòng ngủ 25m
2
11 Sample 11 Yên Lãng –Đống
Đa Mâu bụi trong phòng ngủ 20m
2 12 Sample 12 Nhà số 6, ngách 804/8, ngõ 804 Quang Trung, Phú La, Hà Đông, Hà Nội
Mẫu bụi trong phịng ngủ, diện tích 12m2, gần phòng vệ sinh
13 Sample 13 Mẫu bụi trong nhà vệ sinh, chủ yếu trên thiết bị bình nóng lạnh
14 Sample 14 Phƣơng Trung - Thanh Oai – Hà
Nội
Mẫu bụi trong phòng thờ, chủ yếu là bụi tàn nhang
15 Sample 15 Mẫu bụi trong phòng ngủ, 25m2
2.3.2. Phƣơng pháp phân tích TCS và TCC trên thiết bị LC-MS/MS
2.3.2.1. Điều kiện phân tích TCS và TCC trên thiết bị LC-MS/MS
Điều kiện bộ phận khối phổ MS
Các điều kiện và thông số của thiết bị LC-MS/MS để định lƣợng TCS và TCC đƣợc chúng tôi tham khảo trong 2 tài liệu chính do hãng thiết bị Agilent Technologies cung cấp [4] và trong 1 nghiên cứu đã đƣợc công bố [34]. Các thông số cơ bản của phƣơng pháp đƣợc khảo sát trên thiết bị sắc ký lỏng 2 lần khối phổ Agilent Technologies Triple Quad 6460 LC-MS/MS tại phịng thí nghiệm Trung tâm Phân tích và giám định thực phẩm Quốc gia – Viện Cơng nghiệp thực phẩm.
Hình 2.1. Thiết bị LC-MS/MS và một số thiết bị chính được sử dụng
Thiết bị LC-MS/MS Triple Quad 6460 gồm 2 phần chính: phần sắc ký lỏng cao áp LC 1290 Inifinity và phần khối phổ 2 lần Triple Quad 6460 LC-MS.
Bộ phận khối phổ Triple Quad 6460 LC-MS với các thông số cơ bản sau: Chế độ ion hóa: ion hóa phun điện tử ESI và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển APCI.
Các chƣơng trình khảo sát sự phân mảnh chính: SCAN (quét tất cả mảnh phổ đƣợc ion hóa), SIM (chọn lọc ion mẹ đƣợc ion hóa), MRM (chọn lọc ion con định lƣợng và định tính).
Qua tham khảo một số báo cáo khoa học, việc lựa chọn phổ khối ion mẹ và ion con của hợp chất triclosan và triclocarban thƣờng sử dụng kỹ thuật ion hóa phun điện tử, với chế độ ion âm (ESI-). Nhóm nghiên cứu tiến hành tiêm trực tiếp (khơng qua cột tách sắc ký) chất chuẩn và chất nội chuẩn nồng độ 10 ppm, chế độ scan ion để khảo sát lựa chọn ion mẹ. Sử dụng phần mềm Agilent MassHunter Optimizer để khảo sát tự động, lựa chọn ion con, điện áp Fragmentor và năng lƣợng bắn phá CE tối ƣu.
Sau khi lựa chọn ion mẹ, ion con và các thông số Fragmentor, CE, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát trên bộ phận sắc ký lỏng cao áp.
Bộ phận sắc ký lỏng cao áp LC 1290 Inifinity với thông số sau: áp suất tối đa 1000 Pa, với 4 kênh dung mơi, có thể sử dụng chế độ gradient và hệ thống bơm mẫu tự động thể tích tối đa 20 µL.
Điều kiện HPLC – cột tách và dung mơi
Cột tách góp phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách chất cần xác định, đặc biệt trong nghiên cứu xác định đồng thời nhiều chất thuộc các nhóm chất khác nhau. Lựa chọn cột phân tích phù hợp dựa trên một số tiêu chí sau:
Có thể tách tốt các chất cần xác định; Cột phổ biến, dễ mua, chi phí thấp; Tuổi thọ cột bền;
Pha động sử dụng phổ biến, đơn giản.
Trong nghiên cứu này, cột tách đƣợc khảo sát là cột C18 và cột C8 là các loại cột tách phổ biến trong các phịng thí nghiệm.
Thông số cột tách nhƣ sau:
o Agilent Zorbax SB – C8 (3,5 µm, 2,1 x 100 mm)
o Agilent Poroshell 120 SB – C18 (2,7 µm, 2,1 x 100 mm)
Dung môi thƣờng đƣợc sử dụng cho phân tích sắc ký lỏng 2 lần khối phổ là methanol, acetonitril, dung dịch acid formic 0,1% hoặc acid acetic 0,1% trong nƣớc, dung dịch đệm amoni acetate 5-10 mM. Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát hiệu quả tách và ion hóa của dung mơi, chế độ gradient nhằm tách các chất phân tích, tăng hiệu quả ion hóa và độ nhạy của phƣơng pháp.
2.3.2.2. Đánh giá độ ổn định của tín hiệu phân tích
Để đánh giá sự ổn định của tín hiệu phân tích (diện tích pic) chúng tơi tiến hành phân tích lặp 3 lần các dung dịch chuẩn của triclosan, triclocarban và triclosan
13C12 ở 3 mức nồng độ khác nhau. Diện tích pic trên sắc đồ ion định lƣợng đƣợc lấy ra để tính tốn độ lệch chuẩn tƣơng đối.
2.3.2.3. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị
Hàm lƣợng triclosan và triclocarban trong bụi là tƣơng đối nhỏ (cỡ ppb). Do đó, việc xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của thiết
bị nhằm mục đích đánh giá độ nhạy của thiết bị. Xác định LOD, LOQ của thiết bị đối với chỉ tiêu triclosan và triclocarban dựa trên công thức:
LOD = Nồng độ tại đó có tỉ lệ tín hiệu / nhiễu bằng 3 LOQ = Nồng độ tại đó có tỉ lệ tín hiệu / nhiễu bằng 10
Trong đó, tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) có thể xác định một cách dễ dàng trên phần mềm xử lí số liệu của hệ thống LC-MS/MS. Chúng tơi tính tốn giá trị LOD, LOQ dựa trên điểm chuẩn có nồng độ thấp nhất.
2.3.3. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu
Quy trình xử lý mẫu trong phân tích sắc ký thƣờng gồm 3 bƣớc là chuẩn bị mẫu, chiết mẫu và làm sạch và làm giàu dịch chiết. Trong luận văn này chúng tơi nghiên cứu quy trình phân tích TCS và TCC trong nền mẫu mẫu bụi. Đây là nền mẫu tƣơng đối phức tạp bởi bụi có khả năng hấp phụ nhiều hợp chất trong khơng khí. Do đó, chúng tơi đã sử dụng phƣơng pháp chiết pha rắn (SPE) để tách chiết và làm giàu mẫu đồng thời giảm ảnh hƣởng của nền mẫu, tránh làm nhiễm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện.
2.3.3.1. Các thí nghiệm mẫu trắng
Phân tích mẫu trắng để kiểm tra sự nhiễm bẩn vào mẫu từ mơi trƣờng, dụng cụ, hóa chất, thiết bị. Mẫu trắng có thể chuẩn bị bằng nhiều cách: có thể dùng chất trơ nhƣ Na2SO4 khan hoặc tốt nhất dùng chính mẫu bụi thật (rất khó xác định mẫu bụi hồn tồn khơng có chất phân tích) chiết 3-5 lần bằng dung mơi chiết, sau đó sấy khơ và coi đó là mẫu trắng. Trong trƣờng hợp này, chúng tơi chọn mẫu bụi và loại các chất phân tích bằng cách chiết với dung mơi, khi đó nền mẫu trắng sẽ gần giống với mẫu thật hơn.
Mẫu trắng đƣợc thực hiện trong luận văn này đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: lấy mẫu bụi đã thu thập đƣợc chiết lặp lại 5-7 lần bằng 3 ml ACN, sau đó loại bỏ dịch chiết lấy lại phần cặn của mẫu rồi đem sấy khô ở nhiệt độ 100oC. Mẫu trắng đƣợc gói kín và bảo quản ở nơi khơ ráo, thoáng mát.
2.3.3.2. Thí nghiệm đánh giá quy trình xử lý mẫu
Tách chiết
Tách chiết là bƣớc quan trọng trong q trình phân tích, trong bƣớc này cần phải lựa chọn dung môi để chuyển chất cần xác định từ mẫu phân tích ra dung mơi chiết. Có nhiều loại dung môi khác nhau đƣợc lựa chọn để chiết mẫu. Dung môi đƣợc lựa chọn cần phải hòa tan tốt các chất cần chiết, phổ biến, nhằm đạt đƣợc hiệu suất thu hồi cao nhất.
Triclosan và triclocarban là các hợp chất có độ phân cực vừa phải, có khả năng hịa tan tốt trong một số dung môi nhƣ methanol, acetonitrile… Qua tham khảo một số tài liệu, mẫu bụi thƣờng đƣợc chiết trong dung mơi phân cực vừa, có sử dụng muối Na2SO4 khan để hút nƣớc.
Làm sạch và làm giàu
Trong quá trình chiết rất nhiều tạp chất đi kèm theo vào dịch chiết, bƣớc làm sạch đƣợc thực hiện với mục đích loại bỏ các tạp chất đi kèm mà vẫn giữ đƣợc chất cần phân tích. Trong nghiên cứu này, để làm sạch và làm giàu mẫu, đề tài đã khảo sát sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE).
Nhóm nghiên cứu dự kiến 2 quy trình xử lý mẫu. Với quy trình 1: Mẫu đƣợc đƣa trực tiếp vào cột SPE Florisil đã hoạt hóa, rửa tạp bằng diclometan, rửa giải bởi ACN; quy trình 2: Mẫu đƣợc chiết rắn - lỏng bởi acetonitrile sau đó rửa giải trên cột chiết SPE Florisil đã hoạt hóa.
Thí nghiệm đánh giá hiệu quả làm sạch trên cột chiết pha rắn
Cột chiết pha rắn đƣợc sử dụng để đánh giá hiệu quả chiết, làm sạch và làm giàu triclosan, triclocarban bao gồm:
o Supelclean ENVI – Florisil SPE Tubes with teflon Frits 3 mL, 500 mg (Supelco, Mỹ)
o Cột chiết pha rắn Supelclean LC – NH2 SPE Tubes, 3mL, 500mg (Supelco, Mỹ)
o Cột chiết pha rắn Supelclean LC – Si SPE Tubes, 3mL, 500mg (Supelco, Mỹ)
Đây là các loại cột pha thuận, thƣờng đƣợc sử dụng để phân tích các chất phân cực vừa trong nền mẫu mơi trƣờng.
Hình 2.2. Khảo sát cột chiết pha rắn
2.3.4. Phƣơng pháp xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp
Cách thức đánh giá, xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp dựa trên 2 tài liệu chính là Thẩm định phƣơng pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật – Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia [3] và Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements [8].
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng triclosan và triclocarban từ mẫu bụi trong nhà bằng hệ thống sắc ký lỏng 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) là một phƣơng pháp khơng tiêu chuẩn. Do đó, phƣơng pháp phân tích cần đƣợc đánh giá các thông số sau:
- Tính đặc hiệu, chọn lọc
- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng - Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn
- Độ đúng, đặc trƣng bởi hiệu suất thu hồi R%
- Độ chụm, đặc trƣng bởi độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD %.
2.3.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc
Tính đặc hiệu, chọn lọc: là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có