2.3.4. Phƣơng pháp xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp
Cách thức đánh giá, xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp dựa trên 2 tài liệu chính là Thẩm định phƣơng pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật – Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia [3] và Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements [8].
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng triclosan và triclocarban từ mẫu bụi trong nhà bằng hệ thống sắc ký lỏng 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) là một phƣơng pháp khơng tiêu chuẩn. Do đó, phƣơng pháp phân tích cần đƣợc đánh giá các thơng số sau:
- Tính đặc hiệu, chọn lọc
- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng - Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn
- Độ đúng, đặc trƣng bởi hiệu suất thu hồi R%
- Độ chụm, đặc trƣng bởi độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD %.
2.3.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc
Tính đặc hiệu, chọn lọc: là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác nhƣ các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tƣơng tự, tạp chất ... Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh đƣợc kết quả là dƣơng tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi khơng có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích.
Trong phép phân tích định lƣợng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hƣởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hƣớng đến kết quả chính xác.
Trong phƣơng pháp xác định triclosan và triclocarban này, chúng tôi tiến hành phân tích chất chuẩn, các mẫu trắng và các mẫu trắng thêm chuẩn để đánh giá tính đặc hiệu, chọn lọc của phƣơng pháp.
Ngoài ra, đối với phƣơng pháp phân tích trên thiết bị khối phổ, chúng tôi đánh giá số điểm IP (identification point) để xác định điểm nhận dạng của chất phân tích, nhằm khẳng định chắc chắn sự có mặt của chất phân tích. Số điểm IP đƣợc tính cho 1 ion mẹ là 1 điểm, tính cho 1 ion con là 1,5 điểm [3].
2.3.4.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp
Giới hạn phát hiện (MDL) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc. Giới hạn định lƣợng (MQL) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn [3]. Đối với phƣơng pháp sắc ký, MDL và MQL thƣờng đƣợc xác định dựa trên tín hiệu nhiễu/ nền (S/N) của mẫu trắng thêm chuẩn. Trong luận văn này, sau khi xác định đƣợc giới hạn LOD và LOQ của thiết bị, chúng tôi tiến hành thêm chuẩn vào mẫu trắng ở mức nồng độ tƣơng ứng, xác định S/N để đánh giá MDL và MQL của phƣơng pháp.
2.3.4.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích. Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đƣờng chuẩn và xác định hệ số hồi quy tƣơng quan. Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đƣờng chuẩn ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đƣờng chuẩn tồn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ trong mẫu khơng đƣợc vƣợt ra ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đƣờng chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đƣờng chuẩn [3]. Đối với phƣơng pháp sắc ký khối phổ, việc sử dụng phƣơng pháp xây dựng đƣờng nội chuẩn cho độ tin cậy cao. Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng chất nội chuẩn Triclosan 13C12 cho triclosan và triclocarban.
2.3.4.4. Độ chính xác
Độ chính xác của phƣơng pháp bao gồm độ đúng và độ chụm.
Độ chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ chụm là một khái niệm định tính và đƣợc định lƣợng bởi độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD% hay hệ số biến thiên CV%.
Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực. Độ đúng đƣợc biểu diễn dƣới dạng hiệu suất thu hồi R% của phƣơng pháp.
Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp đƣợc tính theo cơng thức sau: R% = 100 x Cr / Cs
Trong đó:
Cr: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn Cs: Nồng độ thêm chuẩn (lý thuyết)
Độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD% đƣợc tính theo cơng thức:
Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn n: Số lần thí nghiệm
xi: Giá trị tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ “i”
𝑥: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm
Để đánh giá độ đúng và độ chụm của phƣơng pháp xác định triclosan và triclocarban, nhóm nghiên cứu tiến hành thêm chuẩn triclosan, triclocarban trên nền mẫu trắng. Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần tại mức nồng độ 100 ppb đối với triclosan và 10 ppb đối với triclocarban, mức trung bình của TCS, TCC trên mẫu bụi qua tham khảo các nghiên cứu trƣớc đây. Các kết quả đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp dựa trên tiêu chí của AOAC theo bảng sau [3, 8].
Bảng 2.4. Quy định của AOAC về độ chính xác của phương pháp
STT Hàm lƣợng (%)
Tỉ lệ chất Đơn vị Hiệu suất thu hồi R(%) Độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) 1 100 1 100 % 98-102 1,3 2 10 10-1 10 % 98-102 1,8 3 1 10-2 1 % 97-103 2,7 4 0,1 10-3 0,1 % 95-105 3,7 5 0,01 10-4 100 ppm 90-107 5,3 6 0,001 10-5 10 ppm 80-110 7,3 7 0,0001 10-6 1 ppm 80-110 11 8 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 15 9 0,000001 10-8 10 ppb 60-115 21 10 0,0000001 10-9 1 ppb 40-120 30 2.3.5. Phân tích mẫu thực tế
Ứng dụng quy trình phân tích đã đƣợc xác nhận giá trị sử dụng để phân tích các mẫu bụi thu thập tại các khu vực lân cận Hà Nội. Độ chính xác của phƣơng pháp đƣợc đảm bảo ở việc sử dụng chính hợp chất đánh dấu đồng vị 13C12 của các chất phân tích để làm chất nội chuẩn đƣợc thêm vào mẫu ngay từ bƣớc chiết mẫu và trải qua tất cả các bƣớc trong q trình phân tích. Kết quả phân tích mẫu đƣợc tính tốn dựa vào đƣờng nội chuẩn của từng chất phân tích.
2.3.6. Đánh giá mức độ phơi nhiễm thơng qua con đƣờng hấp thụ bụi
Tính tốn lƣợng triclosan và triclocarban nạp vào cơ thể qua tiếp xúc với bụi: Từ thông số hàm lƣợng triclosan và triclocarban trong bụi, cùng với giá trị ƣớc tính là tốc độ hấp thụ bụi có thể tính tốn đƣợc lƣợng hấp thụ hàng ngày (daily intake – DI). Trên cơ sở so sánh với giá trị lƣợng hấp thụ hàng ngày chấp nhận đƣợc
(tolerable daily intake – TDI) có thể đƣa ra những đánh giá ban đầu về rủi ro phơi nhiễm triclosan và triclocarban qua bụi trong nhà.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu trên thiết bị LC-MS/MS 3.1. Kết quả nghiên cứu trên thiết bị LC-MS/MS
3.1.1. Lựa chọn thông số thiết bị khối phổ MS/MS
Triclosan và triclocarban có khối lƣợng phân tử và độ phân cực trung bình. Qua tham khảo một số tài liệu [4, 22, 24], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định triclosan và triclocarban bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm. Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion âm, các ion mẹ có dạng [M-H]. Nhóm nghiên cứu tiến hành tiêm 10 µL chất chuẩn triclosan, triclocarban, triclosan 13C12 nồng độ 10 ppm trực tiếp (không qua cột tách) vào bộ phận khối phổ theo chế độ Scan để xác định ion mẹ đƣợc ion hóa.
Các thơng số cơ bản đƣợc cài đặt nhƣ sau:
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µL
- Chế độ quan sát: SCAN
- Kỹ thuật ion hóa: ESI -
- Nhiệt độ buồng ion hóa: 300oC
- Tốc độ dịng khí N2: 10 L/phút
- Nhiệt độ buồng ion: 300ºC
- Điện áp mao quản: 2000 V (Negative)
- Nebulizer: 50 psi
- Khoảng phổ khối scan: 100 – 400 u
- Thời gian scan: 500 ms
Từ kết quả thu đƣợc khi khảo sát xác định ion mẹ (precusor ion), nhóm nghiên cứu sử dụng phần mềm MassHunting Optimizer tự động lựa chọn ion con (product ion), với các thông số nguồn và khí trên, khảo sát thế phân mảnh Fragmentor (Frag) từ 50 – 140V, thế bắn phá ion (CE) từ 0 - 40V, điều kiện phân mảnh của từng chất đƣợc tối ƣu hóa tự động, thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn ion mẹ và ion con Hợp chất Ion mẹ Hợp chất Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) Dwell Fragmentor (V) CE (V) Sử dụng Triclosan 287 35 100 85 6 Định lƣợng Triclosan 13 C12 299 35 100 85 2 Định lƣợng Triclocarban 313 160 100 90 6 Định lƣợng 126 100 90 20 Định tính
Thơng thƣờng, các chất đƣợc phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) thƣờng lựa chọn đƣợc 2 hay nhiều ion con, trong đó ion con có tín hiệu tốt hơn dùng để định lƣợng và ion con cịn lại dùng để định tính. Tuy nhiên, đối với triclosan và triclosan 13C12, nhóm nghiên cứu chỉ xác định đƣợc 1 ion con có phổ khối là m/z = 35, bởi tính chất của chúng. Điều này cũng diễn ra tƣơng tự nhƣ các tài liệu tham khảo đã công bố [4, 22, 24].
Các thông số ion mẹ và ion con đƣợc cài đặt trong chế độ quan sát ion MRM (Multiple Reaction Monitoring) để chọn lọc ion tốt hơn.
(c)
Hình 3.1. Ion đặc trưng của Triclosan (a), Triclosan 13C12 (b) và Triclocarban (c)
3.1.2. Lựa chọn cột tách và dung mơi pha động
Cột tách có vai trị quan trọng trong việc tách các chất khỏi nhau. Triclosan và triclocarban có độ phân cực trung bình. Đồng thời, theo khuyến nghị của nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an tồn với thiết bị là các dung môi phân cực và phân cực trung bình gồm có methanol, acetonitrile, nƣớc, acid formic (0 - 1%), amoni acetate (0 - 1%)… Cùng với đó, trong điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn khảo sát 2 loại cột tách pha đảo C18 và C8, sử dụng dung môi pha động kênh A: acetonitrile, kênh B: acid formic 0,1% trong nƣớc.
Thông số cột tách đƣợc khảo sát nhƣ sau:
Agilent Zorbax SB – C8 (3,5 µm, 2,1 x 100 mm)
Agilent Poroshell 120 SB – C18 (2,7 µm, 2,1 x 100 mm)
Tiến hành phân tích chất chuẩn TCS nồng độ 100 ppb và TCC nồng độ 10 ppb sử dụng 2 loại cột tách trên, dung môi pha động (A) ACN : (B) acid formic 0,1% = 50 : 50, chế độ đẳng dòng.
Kết quả khi sử dụng cột tách Zorbax SB – C8 (3,5 µm, 2,1 x 100 mm) cho hình ảnh pic cân đối, TCS và TCC tách nhau tốt hơn khi sử dụng cột tách Poroshell 120 SB – C18 (2,7 µm, 2,1 x 100 mm), đồng thời áp suất cột SB – C8 cũng thấp hơn (khoảng 150 bar) so với cột C18 (khoảng 400 bar), đảm bảo độ bền của cột
phân tích. Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn cột tách Zorbax SB – C8 để phân tích TCS và TCC trong bụi.
Trong phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hƣởng tới q trình tách các chất mà nó cịn ảnh hƣởng tới q trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Qua thí nghiệm lựa chọn cột tách, nhóm nghiên cứu sử dụng hệ dung môi ACN : acid formic 0,1% cho tín hiệu pic khá tốt. Tuy nhiên, quá trình tách của TCS, TCS và triclosan 13C12 chƣa thực sự tốt ở chế độ đẳng dòng. Do đó, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát các chế độ gradient cho quá trình tách triclosan và triclocarban. Chƣơng trình gradient đƣợc lựa chọn theo bảng 3.2 dƣới đây:
Bảng 3.2. Chương trình gradient được lựa chọn
Thời gian % A (Acetonitrile) % B (HCOOH 0,1%)
0 – 1 5 95
1 – 4 60 40
4 – 8 60 40
8 – 10 5 95
Hình 3.2. Sắc ký đồ chất chuẩn theo chương trình gradient được lựa chọn
Sắc ký đồ trên cho thấy, triclosan và triclocarban đã tách nhau tốt gần nhƣ hoàn toàn, tăng độ nhạy của phƣơng pháp.
Từ những nghiên cứu trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện tách, định lƣợng triclosan và triclocarban trên thiết bị LC-MS/MS theo bảng 3.3.
Bảng 3.3. Điều kiện tách, định lượng triclosan và triclocarban trên thiết bị LC-MS/MS
TT Điều kiện Thông số
A. Sắc ký lỏng LC 1290
1 Cột tách Zorbax SB – C8 (3,5 µm, 2,1 x 100 mm) 2 Nhiệt độ cột 25 oC
3 Thể tích tiêm mẫu 10,0 μL
4 Pha động Kênh A (ACN), kênh B (HCOOH 0,1%) 5 Tốc độ dịng 0,3 mL/phút
6 Chƣơng trình gradient 0-1 phút: 5% A; 1-4 phút: 60% A; 4-8: 60% A, 8-10 phút: 5% A.
7 Thời gian phân tích 10 phút
B. Khối phổ
1 Chế độ quan sát MRM 2 Kỹ thuật ion hóa ESI - 3 Nhiệt độ buồng ion hóa 300 oC 4 Tốc độ dịng khí N2 10 L/phút
5 Điện áp mao quản 2000 V (Negative) 6 Áp suất dòng phun Nebulizer 50 psi 7 Ion đặc trƣng, thế phân mảnh và năng lƣợng bắn phá TCS: 287 – 35* (Frag 85V, CE 6V) TCS 13C12: 299 – 35* (Frag 85V, CE 2V) TCC : 313 – 160* (Frag 90V, CE 6V) 313 – 126 (Frag 90V, CE 20V) Chú thích: ion (*) là ion định lƣợng
3.1.3. Xây dựng đƣờng chuẩn triclosan và triclocarban
Do tính chất của triclosan và triclocarban tƣơng tự nhau và để tiết kiệm chi phí, nhóm nghiên cứu sử dụng Triclosan 13C12 làm chất nội chuẩn cho triclosan và triclocarban. Chúng tôi đã tiến hành xây dựng đƣờng nội chuẩn 7 điểm sử dụng chất nội chuẩn Triclosan 13C12 (IS) ở nồng độ 20 ppb. Các điểm chuẩn của triclosan có nồng độ từ 10 đến 5000 ppb và của triclocarban từ 1 đến 500 ppb. Cách pha chuẩn đƣợc trình bày ở bảng 2.2. Các điểm chuẩn đƣợc đo ở các điều kiện đã đƣợc chọn lựa tại bảng 3.3. Sự phụ thuộc của tỉ lệ diện tích pic ion định lƣợng của chất chuẩn : nội chuẩn (SStd/ SIS) với tỉ lệ nồng độ chất chuẩn : nội chuẩn (CStd/ CIS) đƣợc biểu diễn theo bảng 3.4.
Bảng 3.4. Sự phụ thuộc giữa diện tích pic (chất chuẩn : nội chuẩn) vào nồng độ (chất chuẩn : nội chuẩn) của triclosan và triclocarban
Điểm chuẩn
Nồng độ điểm chuẩn
TCS/ IS TCS/ IS
CTCS/ CIS STCS/ SIS CTCC/ CIS STCC/ SIS 1 TCS: 10 ppb TCC: 1 ppb IS: 20 ppb 0,5 0,34 0,05 2,26 2 TCS: 50 ppb TCC: 5 ppb IS: 20 ppb 2,5 1,88 0,25 10,33 3 TCS: 100 ppb TCC: 10 ppb IS: 20 ppb 5 3,73 0,5 23,25 4 TCS: 200 ppb TCC: 20 ppb IS: 20 ppb 10 8,09 1 47,06 5 TCS: 500 ppb TCC: 50 ppb IS: 20 ppb 50 20,58 2,5 120,05 6 TCS: 1000 ppb TCC: 100 ppb IS: 20 ppb 100 42,83 5 279,69 7 TCS: 5000 ppb TCC: 500 ppb IS: 20 ppb 500 218,54 25 1350,30
Từ kết quả phân tích, chúng tơi sử dụng phần mềm Agilent QQQ Quantitative Analysis để xây dựng đƣờng nội chuẩn và xác định khoảng tuyến tính của chất phân tích. Kết quả xây dựng đƣờng nội chuẩn đƣợc biểu diễn tại hình 3.3.
(a)
(b)
Hình 3.3. Đường nội chuẩn của triclosan (a) và triclocarban (b)
Nhận xét: Tại nồng độ chất chuẩn từ 10 - 1000 ppb, các điểm nồng độ của
TCS phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tƣơng quan R2 = 0,9997, tại điểm C TCS/ C IS S TC S / S IS C TCS/ C IS S TC S / S IS
chuẩn nồng độ TCS 5000 ppb, giá trị tỉ lệ tín hiệu chất chuẩn / chất nội chuẩn không cịn tuyến tính. Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn khoảng tuyến tính của TCS là từ 10 – 1000 ppb.
Đối với TCC, tỉ lệ diện tích pic phụ thuộc tuyến tính với tỉ lệ nồng độ trên các điểm chuẩn đƣợc nghiên cứu từ 1 – 500 ppb, với giá trị R2 = 0,9996. Do đó, chúng tơi lựa chọn khoảng tuyến tính của TCC là từ 1 – 500 ppb.
Với khoảng tuyến tính này, phƣơng pháp hồn tồn có thể xác định lƣợng vết TCS, TCC trong các mẫu bụi cần nghiên cứu.
3.1.4. Độ ổn định của tín hiệu chất phân tích
Độ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích pic sắc ký của ion định lƣợng đối với chất chuẩn và nội chuẩn, mỗi dung dịch đƣợc phân tích lặp lại 3 lần, ở 3 mức nồng độ đƣợc đƣa ra trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic sắc ký khi phân tích lặp lại 3 lần dung dịch chuẩn ở 3 nồng độ khác nhau
TT Nồng độ RSD (%), n=3
TCS TCC IS TCS TCC IS
1 10 1 20 4,5 3,8 3,5
2 100 10 20 3,4 3,2 2,9
3 1000 100 20 3,1 2,7 3,1
Tại 3 mức nồng độ của hỗn hợp dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tƣơng đối