Hợp chất Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) Dwell Fragmentor (V) CE (V) Sử dụng Triclosan 287 35 100 85 6 Định lƣợng Triclosan 13 C12 299 35 100 85 2 Định lƣợng Triclocarban 313 160 100 90 6 Định lƣợng 126 100 90 20 Định tính
Thơng thƣờng, các chất đƣợc phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) thƣờng lựa chọn đƣợc 2 hay nhiều ion con, trong đó ion con có tín hiệu tốt hơn dùng để định lƣợng và ion con cịn lại dùng để định tính. Tuy nhiên, đối với triclosan và triclosan 13C12, nhóm nghiên cứu chỉ xác định đƣợc 1 ion con có phổ khối là m/z = 35, bởi tính chất của chúng. Điều này cũng diễn ra tƣơng tự nhƣ các tài liệu tham khảo đã công bố [4, 22, 24].
Các thông số ion mẹ và ion con đƣợc cài đặt trong chế độ quan sát ion MRM (Multiple Reaction Monitoring) để chọn lọc ion tốt hơn.
(c)
Hình 3.1. Ion đặc trưng của Triclosan (a), Triclosan 13C12 (b) và Triclocarban (c)
3.1.2. Lựa chọn cột tách và dung mơi pha động
Cột tách có vai trị quan trọng trong việc tách các chất khỏi nhau. Triclosan và triclocarban có độ phân cực trung bình. Đồng thời, theo khuyến nghị của nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an tồn với thiết bị là các dung môi phân cực và phân cực trung bình gồm có methanol, acetonitrile, nƣớc, acid formic (0 - 1%), amoni acetate (0 - 1%)… Cùng với đó, trong điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn khảo sát 2 loại cột tách pha đảo C18 và C8, sử dụng dung môi pha động kênh A: acetonitrile, kênh B: acid formic 0,1% trong nƣớc.
Thông số cột tách đƣợc khảo sát nhƣ sau:
Agilent Zorbax SB – C8 (3,5 µm, 2,1 x 100 mm)
Agilent Poroshell 120 SB – C18 (2,7 µm, 2,1 x 100 mm)
Tiến hành phân tích chất chuẩn TCS nồng độ 100 ppb và TCC nồng độ 10 ppb sử dụng 2 loại cột tách trên, dung môi pha động (A) ACN : (B) acid formic 0,1% = 50 : 50, chế độ đẳng dòng.
Kết quả khi sử dụng cột tách Zorbax SB – C8 (3,5 µm, 2,1 x 100 mm) cho hình ảnh pic cân đối, TCS và TCC tách nhau tốt hơn khi sử dụng cột tách Poroshell 120 SB – C18 (2,7 µm, 2,1 x 100 mm), đồng thời áp suất cột SB – C8 cũng thấp hơn (khoảng 150 bar) so với cột C18 (khoảng 400 bar), đảm bảo độ bền của cột
phân tích. Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn cột tách Zorbax SB – C8 để phân tích TCS và TCC trong bụi.
Trong phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hƣởng tới q trình tách các chất mà nó cịn ảnh hƣởng tới q trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Qua thí nghiệm lựa chọn cột tách, nhóm nghiên cứu sử dụng hệ dung môi ACN : acid formic 0,1% cho tín hiệu pic khá tốt. Tuy nhiên, quá trình tách của TCS, TCS và triclosan 13C12 chƣa thực sự tốt ở chế độ đẳng dòng. Do đó, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát các chế độ gradient cho quá trình tách triclosan và triclocarban. Chƣơng trình gradient đƣợc lựa chọn theo bảng 3.2 dƣới đây:
Bảng 3.2. Chương trình gradient được lựa chọn
Thời gian % A (Acetonitrile) % B (HCOOH 0,1%)
0 – 1 5 95
1 – 4 60 40
4 – 8 60 40
8 – 10 5 95
Hình 3.2. Sắc ký đồ chất chuẩn theo chương trình gradient được lựa chọn
Sắc ký đồ trên cho thấy, triclosan và triclocarban đã tách nhau tốt gần nhƣ hoàn toàn, tăng độ nhạy của phƣơng pháp.
Từ những nghiên cứu trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện tách, định lƣợng triclosan và triclocarban trên thiết bị LC-MS/MS theo bảng 3.3.
Bảng 3.3. Điều kiện tách, định lượng triclosan và triclocarban trên thiết bị LC-MS/MS
TT Điều kiện Thông số
A. Sắc ký lỏng LC 1290
1 Cột tách Zorbax SB – C8 (3,5 µm, 2,1 x 100 mm) 2 Nhiệt độ cột 25 oC
3 Thể tích tiêm mẫu 10,0 μL
4 Pha động Kênh A (ACN), kênh B (HCOOH 0,1%) 5 Tốc độ dòng 0,3 mL/phút
6 Chƣơng trình gradient 0-1 phút: 5% A; 1-4 phút: 60% A; 4-8: 60% A, 8-10 phút: 5% A.
7 Thời gian phân tích 10 phút
B. Khối phổ
1 Chế độ quan sát MRM 2 Kỹ thuật ion hóa ESI - 3 Nhiệt độ buồng ion hóa 300 oC 4 Tốc độ dịng khí N2 10 L/phút
5 Điện áp mao quản 2000 V (Negative) 6 Áp suất dòng phun Nebulizer 50 psi 7 Ion đặc trƣng, thế phân mảnh và năng lƣợng bắn phá TCS: 287 – 35* (Frag 85V, CE 6V) TCS 13C12: 299 – 35* (Frag 85V, CE 2V) TCC : 313 – 160* (Frag 90V, CE 6V) 313 – 126 (Frag 90V, CE 20V) Chú thích: ion (*) là ion định lƣợng
3.1.3. Xây dựng đƣờng chuẩn triclosan và triclocarban
Do tính chất của triclosan và triclocarban tƣơng tự nhau và để tiết kiệm chi phí, nhóm nghiên cứu sử dụng Triclosan 13C12 làm chất nội chuẩn cho triclosan và triclocarban. Chúng tôi đã tiến hành xây dựng đƣờng nội chuẩn 7 điểm sử dụng chất nội chuẩn Triclosan 13C12 (IS) ở nồng độ 20 ppb. Các điểm chuẩn của triclosan có nồng độ từ 10 đến 5000 ppb và của triclocarban từ 1 đến 500 ppb. Cách pha chuẩn đƣợc trình bày ở bảng 2.2. Các điểm chuẩn đƣợc đo ở các điều kiện đã đƣợc chọn lựa tại bảng 3.3. Sự phụ thuộc của tỉ lệ diện tích pic ion định lƣợng của chất chuẩn : nội chuẩn (SStd/ SIS) với tỉ lệ nồng độ chất chuẩn : nội chuẩn (CStd/ CIS) đƣợc biểu diễn theo bảng 3.4.
Bảng 3.4. Sự phụ thuộc giữa diện tích pic (chất chuẩn : nội chuẩn) vào nồng độ (chất chuẩn : nội chuẩn) của triclosan và triclocarban
Điểm chuẩn
Nồng độ điểm chuẩn
TCS/ IS TCS/ IS
CTCS/ CIS STCS/ SIS CTCC/ CIS STCC/ SIS 1 TCS: 10 ppb TCC: 1 ppb IS: 20 ppb 0,5 0,34 0,05 2,26 2 TCS: 50 ppb TCC: 5 ppb IS: 20 ppb 2,5 1,88 0,25 10,33 3 TCS: 100 ppb TCC: 10 ppb IS: 20 ppb 5 3,73 0,5 23,25 4 TCS: 200 ppb TCC: 20 ppb IS: 20 ppb 10 8,09 1 47,06 5 TCS: 500 ppb TCC: 50 ppb IS: 20 ppb 50 20,58 2,5 120,05 6 TCS: 1000 ppb TCC: 100 ppb IS: 20 ppb 100 42,83 5 279,69 7 TCS: 5000 ppb TCC: 500 ppb IS: 20 ppb 500 218,54 25 1350,30
Từ kết quả phân tích, chúng tơi sử dụng phần mềm Agilent QQQ Quantitative Analysis để xây dựng đƣờng nội chuẩn và xác định khoảng tuyến tính của chất phân tích. Kết quả xây dựng đƣờng nội chuẩn đƣợc biểu diễn tại hình 3.3.
(a)
(b)
Hình 3.3. Đường nội chuẩn của triclosan (a) và triclocarban (b)
Nhận xét: Tại nồng độ chất chuẩn từ 10 - 1000 ppb, các điểm nồng độ của
TCS phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tƣơng quan R2 = 0,9997, tại điểm C TCS/ C IS S TC S / S IS C TCS/ C IS S TC S / S IS
chuẩn nồng độ TCS 5000 ppb, giá trị tỉ lệ tín hiệu chất chuẩn / chất nội chuẩn không cịn tuyến tính. Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn khoảng tuyến tính của TCS là từ 10 – 1000 ppb.
Đối với TCC, tỉ lệ diện tích pic phụ thuộc tuyến tính với tỉ lệ nồng độ trên các điểm chuẩn đƣợc nghiên cứu từ 1 – 500 ppb, với giá trị R2 = 0,9996. Do đó, chúng tơi lựa chọn khoảng tuyến tính của TCC là từ 1 – 500 ppb.
Với khoảng tuyến tính này, phƣơng pháp hồn tồn có thể xác định lƣợng vết TCS, TCC trong các mẫu bụi cần nghiên cứu.
3.1.4. Độ ổn định của tín hiệu chất phân tích
Độ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích pic sắc ký của ion định lƣợng đối với chất chuẩn và nội chuẩn, mỗi dung dịch đƣợc phân tích lặp lại 3 lần, ở 3 mức nồng độ đƣợc đƣa ra trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic sắc ký khi phân tích lặp lại 3 lần dung dịch chuẩn ở 3 nồng độ khác nhau
TT Nồng độ RSD (%), n=3
TCS TCC IS TCS TCC IS
1 10 1 20 4,5 3,8 3,5
2 100 10 20 3,4 3,2 2,9
3 1000 100 20 3,1 2,7 3,1
Tại 3 mức nồng độ của hỗn hợp dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích pic sắc ký của các chất phân tích sau 3 lần bơm lặp lại nằm trong khoảng 2,7% - 4,5%. So sánh với giới hạn cho phép của RSD% ở mức nồng độ 10 – 1000 ppb là 11% theo AOAC thì thiết bị LC-MS/MS chúng tơi sử dụng để nghiên cứu cho tín hiệu phân tích ổn định.
Khi các thông số của hệ thống LC-MS/MS đạt đến giá trị cài đặt, để tín hiệu phân tích ổn định thì nên bơm mẫu sau ít nhất 30 phút nếu máy đang ở chế độ chờ (Stand by) và sau ít nhất 3 giờ nếu máy đƣợc khởi động lại. Trong thời gian phân tích mẫu, khơng nên tắt hệ thống sau mỗi ngày mà nên đặt ở chế độ chờ. Nếu khởi
động lại máy thì cần thời gian để đạt đƣợc điều kiện chân không trong detector khối phổ.
3.1.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của thiết bị
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của thiết bị đối với triclosan và triclocarban đƣợc xác định dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) của dung dịch chuẩn có nồng độ thấp nhất. Tƣơng ứng với 3 ≤ S/N < 10, nồng độ chuẩn tại đó đƣợc xác định là giới hạn phát hiện (LOD) của thiết bị. Với S/N ≥ 10, nồng độ chuẩn tại đó đƣợc xác định là giới hạn định lƣợng (LOQ) của thiết bị. Giá trị LOD, LOQ của các chất phân tích đƣợc đƣa ra trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị
Hợp chất Giới hạn phát hiện (ppb) Giới hạn định lƣợng (ppb) TCS 3,0 10,0 TCC 0,3 1,0
Nhận xét: Với giá trị giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng trên, phƣơng
pháp có độ nhạy cao, có thể phân tích lƣợng vết triclosan và triclocarban trong đối tƣợng mẫu bụi.
3.2. Kết quả nghiên cứu quy trình xử lý mẫu 3.2.1. Kết quả thí nghiệm đối với mẫu trắng 3.2.1. Kết quả thí nghiệm đối với mẫu trắng
Sắc ký đồ thu đƣợc từ các mẫu trắng thiết bị, dung mơi, hóa chất, dụng cụ đều khơng có sự xuất hiện của pic lạ và có đƣờng nền ổn định. Đối với thiết bị phân tích, hệ thống LC-MS/MS cũng nhƣ cột tách đều mới đƣợc đƣa vào sử dụng nên các yếu tố nhiễm bẩn từ thiết bị rất hạn chế. Các dung mơi sử dụng trong quy trình xử lí mẫu đều có độ tinh khiết cao, các hóa chất nhƣ các loại chất hấp phụ và natri sunfat đều đƣợc hoạt hóa và nung ở nhiệt độ cao, dung mơi và hóa chất đều đƣợc cung cấp bởi các hãng hóa chất có uy tín nên khơng phát hiện đƣợc sự nhiễm bẩn từ dung mơi và hóa chất. Dụng cụ thủy tinh dùng để xử lí mẫu đều đƣợc rửa sạch bằng nƣớc xà phòng, rung siêu âm, ngâm trong dung dịch oxi hóa mạnh, tráng với nƣớc cất và các dung môi sạch nhƣ acetone, n-hexane rồi giữ trong các thùng chứa sạch
và kín nên cũng khơng gây nhiễm bẩn cho mẫu. Với mẫu trắng là mẫu bụi, sau khi đã chiết lặp lại nhiều lần bởi ACN, loại bỏ dung môi và nung ở nhiệt độ cao, sau đó chiết bởi quy trình chiết dự kiến, sắc ký đồ cũng cho thấy nồng độ triclosan và triclocarban cũng thấp hơn giới hạn phát hiện của thiết bị. Do đó, chúng tơi tiếp tục tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu quy trình và phân tích mẫu thật.
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu trắng trên nền mẫu bụi
3.2.2. Kết quả các thí nghiệm chọn quy trình chiết
Trong mẫu bụi, lƣợng chất TCS khá thấp và chứa nhiều tạp chất, do đó trƣớc khi đo trên thiết bị LS - MS/MS cần phải xử lý, tách chiết mẫu để làm giàu mẫu, loại tạp chất, giảm ảnh hƣởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện. Qua tham khảo các nghiên cứu trƣớc đây, chúng tôi khảo sát trên 2 quy trình chiết khác nhau đối với mẫu bụi theo hình 3.5. Để đánh giá hiệu quả xử lý mẫu, chúng tôi tiến hành khảo sát trên nền mẫu trắng thêm chuẩn TCS ở mức nồng độ 100 ppb và TCC ở nồng độ 10 ppb. Độ thu hồi của phƣơng pháp theo các công thức sau:
R% = Cr
Cs × 100
Trong đó: R%: Độ thu hồi (%). Cr: Nồng độ thu hồi (ppb).
3.2.2.1. Độ thu hồi TCS và TCC trong 2 quy trình xử lý mẫu
Quy trình 1: mẫu bụi thêm chuẩn đƣợc cho trực tiếp lên cột SPE ENVI - Florisil đƣợc hoạt hóa bởi diclomethan rồi chiết trực tiếp trên cột SPE bằng acetonitrile. Quy trình 2: mẫu bụi thêm chuẩn đƣợc chiết rắn – lỏng với acetonitrile (3 ml x 3
lần) rồi chuyển dịch chiết vào cột SPE ENVI - Florisil.
Quy trình xử lý mẫu 1 Quy trình xử lý mẫu 2
Cân 0,5 g bụi vào ống nghiệm thủy tinh 10 ml
+ 100 µL IS 100 ppb + 0,5 g Na2SO4 khan Chiết pha rắn bởi cột Florisil
- Hoạt hóa: 5 mL DCM - Nạp mẫu
- Rửa tạp: 10 mL DCM - Rửa tạp: 10 mL ACN Chuyển vào vial 15 mL
Thổi khơ N2 về thể tích 0,5 mL
Lọc qua màng lọc 0,2 µm
LC - MS/MS
Cân 0,5 g bụi vào ống nghiệm thủy tinh 10 ml
+ 100 µL IS 100 ppb + 0,5 g Na2SO4 khan
Ly tâm, chuyển dịch chiết vào vial 15 ml
- Hoạt hóa: 5 mL DCM - Nạp mẫu và rửa giải trực tiếp dịch chiết Thổi khơ N2 về thể tích 0,5 mL Lọc qua màng lọc 0,2 µm LC - MS/MS Chiết rắn - lỏng lặp lại 3 lần x 3 mL ACN
Chiết pha rắn bởi cột Florisil
Các mẫu trắng đƣợc thêm chuẩn TCS nồng độ 100 ppb, TCC nồng độ 10 ppb, nội chuẩn nồng độ 20 ppb, đo trong cùng một điều kiện đã xác định ở trên. Kết quả thu đƣợc trong bảng 3.7. (sắc ký đồ khảo sát 2 quy trình đƣợc trình bày ở phụ lục).
Bảng 3.7. Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Quy trình Nồng độ thu hồi Ctt (ppb) Hiệu suất R%
TCS TCC TCS TCC
1 67,3 6,85 67,3 68,5
2 84,3 8,71 84,3 87,1
Nhận xét: Với quy trình xử lý mẫu 2, khi chiết rắn – lỏng bởi ACN và làm
giàu bởi cột SPE Florisil, hiệu suất thu hồi của cả triclosan và triclocarban đều cao hơn khi xử lý mẫu theo quy trình 1. Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn quy trình 2 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2.2. Độ thu hồi TCS và TCC trong quá trình chiết rắn - lỏng và làm sạch bằng cột chiết pha rắn bằng cột chiết pha rắn
Việc chiết tách, làm sạch và làm giàu mẫu là khâu rất quan trọng cho mọi quá trình phân tích, đặc biệt là những chất phân tích có hàm lƣợng nhỏ trong mẫu. Ảnh hƣởng của giai đoạn này rất lớn, có thể chiếm tới 70% sai số của cả q trình phân tích. Trong nội dung nghiên cứu của đề tài này, để đảm bảo cho việc chiết tách, làm sạch triclosan và triclocarban từ mẫu bụi, nhóm nghiên cứu đã tiến hành xử lý mẫu theo các bƣớc sau:
Tách chiết
Việc lựa chọn phƣơng pháp chiết tách trong phân tích các chất ở lƣợng vết có vai trị rất lớn vì trong các mẫu thƣờng chứa nhiều chất khác nhau, có khả năng làm ảnh hƣởng tới tách chiết của chất nghiên cứu. Chính vì vậy dung mơi chiết tách mẫu phải có tính chọn lọc cao.
Trong nghiên cứu này, triclosan và triclocarban có tính phân cực vừa, có khả năng tan tốt trong các dung mơi nhƣ acetone, acetonitrile, methanol... Thí nghiệm thực hiện với 0,5g mẫu trắng bụi thêm chuẩn 100 ppb triclosan và 10 ppb
triclocarban, chiết bởi 3 dung môi acetonitrile, acetone, methanol, làm sạch theo quy trình 2. Kết quả thu đƣợc hiệu suất thu hồi của triclosan và triclocarban khi chiết trong acetonitrile, methanol và acetone theo bảng 3.8.
Bảng 3.8. Khảo sát dung môi chiết
Dung môi Hiệu suất thu hồi R%
TCS TCC
Acetonitrile 82,5 88,9
Acetone 55,6 52,3
Methanol 74,8 71,7
Làm sạch và làm giàu
Nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá hiệu quả của 3 loại cột chiết pha rắn SPE cho quá trình làm sạch triclosan và triclocarban trong mẫu bụi gồm: cột chiết Supelclean ENVI – Florisil, 3 mL, 500 mg; Supelclean LC – NH2, 3mL, 500mg; LC – Si, 3 mL, 500mg. Cả 3 loại cột chiết này thƣờng đƣợc sử dụng trong phân tích các mẫu mơi trƣờng. Mẫu bụi thêm chuẩn ở nồng độ 100 ng/g đối với triclosan và 10 ng/g đối với triclocarban, quá trình xử lý mẫu bằng phƣơng pháp chiết rắn lỏng với ACN và chiết pha rắn đối với các cột SPE đƣợc khảo sát. Kết quả khảo sát đƣợc xác định tại bảng 3.8.
Bảng 3.9. Khảo sát hiệu quả cột SPE