Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình như sơ đồ sau:
Hình 12. Quy trình nghiên cứu phát triển KIT chẩn đoán phytoplasma gây bệnh chổi rồng trên sắn dựa trên kỹ thuật LAMP
2.2.1. Xác định sự nhiễm phytoplasma chổi rồng bằng kỹ thuật PCR lồng
Phản ứng nested PCR được tham khảo có cải biến từ các cơng trình đã được cơng bố, [2, 7] gồm 3 vòng với thành phần và các chu trình nhiệt như sau:
Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR lồng
Thành phần Nồng độ cuối Thành phần Nồng độ cuối
Đệm 10x 1x dNTP (10mM) 0,25 mM
Mồi xi (10µM) 0,25 µM Taq polymerase 0,6 Unit
Mồi ngược (10µM) 0,25 µM ADN 200 ng
Bảng 6. Trình tự các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR lồng
Cặp mồi Tên mồi Trình tự
1 P1A ACGCTGGCGGCGCGCCTTAATAC P7A CCTTCATCGGCTCTTAGTGC 2 R16F2n GAAACGACTGCTAAGACTGG R16R2 TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 3 R16(I)F1 TAAAAGACCTAGCAATAGG R16(I)R1 CAATCCGAACTGAGACTGT
Bảng 7. Các chu trình nhiệt của phản ứng PCR lồng
Vòng Nhiệt độ 94°C 94°C 55°C 72°C 72°C 15°C
1 Thời gian
4 phút 1 phút 2 phút 3 phút 7 phút 10 phút
Số chu kỳ 1 chu kỳ 38 chu kỳ 1 chu kỳ 1 chu kỳ
2 Nhiệt độ 94°C 94°C 50°C 72°C 72°C 10°C Thời gian 1phút 30 giây 30 giây 50 giây 1 phút 20 giây 10 phút 10 phút
Số chu kỳ 1 chu kỳ 30 chu kỳ 1 chu kỳ 1 chu kỳ
3
Nhiệt độ 94°C 94°C 50°C 72°C 72°C 10°C
Thời gian 1phút 30
giây
1 phút 2 phút 3 phút 10 phút 15 phút
Số chu kỳ 1 chu kỳ 34 chu kỳ 1 chu kỳ 1 chu kỳ
Sản phẩm của phản ứng PCR lồng được điện di trên gel Agarose 2%, nhuộm ethidium bromide và hiển thị dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254nm.
2.2.2. Tách dịng đoạn ADN mã hóa cho 16S rRNA vào vector pGEM-T
Cây sắn có triệu chứng của bệnh chổi rồng được thu thập, tách ADN và tái khẳng định sự nhiễm bệnh của phytoplasma bằng phương pháp PCR lồng.
Sản phẩm của bước PCR thứ 2 của PCR lồng được gắn vào vector pGEM-T để tạo plasmid mang gen nghiên cứu. Plasmid mang đoạn ADN mã hóa 16S rRNA được giải trình tự và so sánh với trình tự mã hóa cho gen 16S rRNA của phytoplasma gây bệnh chổi rồng trên cây sắn phân lập được tại Việt Nam, đã công bố trên ngân hàng gen để khẳng
định lại trình tự (mã số trên ngân hàng gen JQ973105.1). Trình tự sau khi được tái khẳng định được dùng để thiết kế các bộ mồi cho phản ứng LAMP. Plasmid mang đoạn ADN này được dùng làm khn trong suốt q trình tối ưu hóa các điều kiện phản ứng LAMP.
2.2.3. Thiết kế mồi LAMP
Mồi của phản ứng LAMP được thiết kế dựa trên khn là đoạn trình tự ADN mục tiêu đặc hiệu cho phytoplasma. Mồi được thiết kế bằng phần mềm chuyên dụng PrimerExplore trực tuyến trên trang web https://primerexplorer.jp/e/
Thiết kế mồi được áp dụng dựa trên một số tiêu chí chính như sau: [98] - Khoảng cách giữa các mồi
+ Khoảng cách giữa đầu 5' của F2 và B2 khoảng 120-180bp, và khoảng cách giữa mồi F2 với F3 và giữa B2 với B3 khoảng 0-20bp.
+ Khoảng cách (giữa đầu 5' của F2 đến đầu 3' của F1, và khoảng cách giữa đầu 5' của B2 đến đầu 3' của B1) để tạo cấu trúc vòng từ 40-60bp.
- Nhiệt độ gắn mồi: Khoảng 60-65°C. - Thành phần GC chiếm khoảng 40-65%
- Cấu trúc bậc 2: Mồi cần được thiết kế để tránh hình thành các cấu trúc bậc 2. Đầu 3’ không nên giàu thành phần AT hoặc dễ dàng bắt cặp bổ sung với các mồi khác. - Độ dài đoạn khuếch đại thường không quá 200 bp.
- u cầu khác: Nếu có vị trí cắt của enzyme giới hạn tồn tại trong trình tự đích, cần tránh vị trí gắn mồi.
Song song với việc thiết kế mồi dựa vào phần mềm miễn phí của Primerexproler, trình tự mồi cịn được thiết kế độc lập bằng phần mềm chuyên dụng LAMP Designer của PREMIER Biosoft (Hoa Kỳ) với các yêu cầu tương tự như trên. Sau khi thiết kế, mồi được tổng hợp tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) để thực hiện các thí nghiệm LAMP.
2.2.4. Xác định điều kiện phản ứng phù hợp cho các bộ mồi
Phản ứng LAMP bao gồm các thành phần như trong bảng sau:
Bảng 8. Thành phần hỗn hợp phản ứng LAMP
Thành phần Nồng độ cuối Thành phần Nồng độ cuối
Đệm 10x 2 µl dNTPs 1,4 mM
Mồi FIP 1,6 µM MgSO4 6,0 mM
Mồi BIP 1,6 µM Enzyme Bst 2.0 8 U
Mồi F3 0,2 µM ADN khn ~50 ng
Mồi B3 0,2 µM H2O Bổ sung để được 20 µl
Phản ứng được tiến hành dưới các điều kiện nhiệt độ 60°C, 62°C, 63°C và 64°C nhằm tìm được nhiệt độ phù hợp cho phản ứng đạt hiệu quả khuếch đại cao nhất.
Bên cạnh đó, chất chỉ thị màu cho phản ứng cũng được bổ sung với nồng độ phù hợp sau khi tiến hành thử nghiệm các nồng độ phù hợp nhất cho phản ứng LAMP.
2.2.5. Các phương pháp kiểm tra kết quả
Kết quả của phản ứng được kiểm tra bằng cách bổ sung chất chỉ thị màu, đồng thời đánh giá theo sự xuất hiện của chất kết tủa dưới đáy ống và kiểm tra lại bằng điện di sản phẩm trên gel agarose 2%, nhuộm ethidium và soi dưới ánh sáng UV.
Đối với chất chỉ thị màu, phản ứng LAMP được thực hiện với 2 chất chỉ thị màu khác nhau là Calcein và hydroxynapthol blue (HNB). Chất chỉ thị nào thể hiện sự khác biệt rõ ràng nhất sẽ được lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo của nghiên cứu. Sau đó, thử nghiệm nồng độ chất màu phù hợp cho phản ứng. Sản phẩm của phản ứng được quan sát bằng mắt thường dưới ánh sáng trắng dựa vào màu sắc của dung dịch sau phản ứng. Xét theo màu sắc của phản ứng, khi bổ sung HNB, nếu phản ứng LAMP diễn ra, hỗn hợp phản ứng sẽ chuyển từ màu tím hoặc xanh đậm sang màu xanh lam nhạt. Ngược lại, nếu phản ứng không xảy ra, dung dịch trong ống sẽ giữ nguyên màu sắc như ban đầu. Nếu bổ sung vào phản ứng chất chỉ thị màu là Calcein, phản ứng dương tính có màu xanh lục, cịn âm tính có màu vàng nhạt.
Sau khi chọn lựa được chất chỉ thị màu, sẽ tiến hành thử nồng độ phù hợp của chất chỉ thị để phản ứng đạt hiệu quả tốt nhất.
Bên cạnh đó, sản phẩm của phản ứng LAMP cịn được nhận biết do có sự kết tủa màu trắng trong khi những mẫu khơng xảy ra phản ứng thì khơng có hiện tượng này.
Sản phẩm của phản ứng LAMP còn được hiển thị trên gel Agarose 2% dưới ánh sáng UV có bước sóng 254nm, sau khi điện di dưới dòng điện 1 chiều 100V trong 40 phút.
2.2.6. Xác định độ nhạy của các bộ mồi
Để đánh giá độ nhạy của LAMP, Một thí nghiệm LAMP được thiết kế với hàm lượng ADN khn được pha lỗng từ 100-108 lần, với hàm lượng 100 chính là hàm lượng ADN thu được sau khi tách chiết. Hàm lượng ADN thấp nhất mà LAMP có thể xác định được chính là độ nhạy của phép thử này.
2.2.7. Xác định độ đặc hiệu của các bộ mồi
Để xác định độ đặc hiệu của mồi, một thí nghiệm LAMP được thiết kế với thành phần như bảng 5, trong đó, sử dụng các ADN khn là ADN tách chiết từ sắn sạch bệnh và plasmid mang gen 16S rDNA của phytoplasma và kiểm tra mức độ phản ứng chéo của mồi. Kết quả của phản ứng được điện di trên gel Agarose 2%, nhuộm ethidium và hiển thị dưới ánh sáng UV có bước sóng 254 nm.
2.2.8. Xác định trên mẫu bệnh từ đồng ruộng
Xác định phytoplasma trên các mẫu sắn được thu thập từ đồng ruộng nhằm phát triển kit chẩn đoán, dựa trên những kết quả thu được từ thí nghiệm với cặp mồi đặc hiệu với LAMP. Kit bao gồm bộ mồi đặc hiệu cho tác nhân gây bệnh (phytoplasma) và bộ mồi đặc hiệu cho gen Actin nhằm kiểm tra chất lượng ADN của đối tượng vật chủ (sắn). Điều kiện phản ứng được thiết kế sao cho có sự tượng đồng lớn nhất giữa hai bộ mồi. Với chất lượng ADN tốt, phản ứng dương tính ln ln xuất hiện khi phản ứng với bộ mồi đặc hiệu cho sắn. Ngược lại, đối với bộ mồi dành cho phytoplasma, phản ứng có thể dương tính hoặc âm tính phụ thuộc vào sự tồn tại của phytoplasma trong đối tượng vật chủ được nghiên cứu.
Kiểm tra độ chính xác của KIT bằng kỹ thuật PCR lồng. Phản ứng PCR lồng được thiết kế và thực hiện như trong mục 2.2.1.
So sánh kết quả của phản ứng PCR lồng và phản ứng LAMP để đánh giá mức độ nhạy của phản ứng LAMP.