Xác định nhiệt độ phù hợp cho phản ứng LAMP với cặp mồi nội chuẩn

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) phát triển kít chẩn đoán phytoplasma gây bệnh chổi rồng trên sắn dựa trên kỹ thuật lamp (Trang 68 - 69)

M: ADN thang chuẩn 1000 bp; Mẫu 1, 2: phản ứng ở 60°C, Mẫu 3, 4: phản ứng ở 61°C; Mẫu 5,6: phản ứng ở 62°C; mẫu 7,8: phản ứng ở 63°C, mẫu 9,10: phản ứng ở 64°C. Mẫu 1,3,5,7,9: âm tính đối chứng; mẫu 2,4,6,8,10: mẫu dương tính.

Dựa vào hình ảnh điện di, phản ứng LAMP với cặp mồi đặc hiệu cho gen Actin phản ứng ở nhiệt độ từ 61°C-64°C, trong đó, hiệu quả phản ứng trong điều kiện nhiệt độ từ 61°C đến 63°C khơng có sự khác biệt đáng kể, thể hiện ở số băng điện di nhiều, dày và sáng rõ, chứng tỏ sản phẩm ADN được tạo thành với lượng rất lớn. Trong khi đó, ở nhiệt độ 64°C, sản phẩm khuếch đại mặc dù vẫn được tạo thành nhưng số lượng ít hơn hẳn, thẻ hiện ở số băng điện di tương đối mờ nhạt khi được nhuộm với ethidium bromide và hiển thị dưới tia UV. Với nhiệt độ 60°C, khơng có bất cứ sản phẩm khuếch đại nào được hiển thị, chứng tỏ điều kiện nhiệt độ này hồn tồn khơng phù hợp với phản ứng LAMP với các cặp mồi được thiết kế trong nghiên cứu này.

So sánh giữa sự thay đổi màu sắc của HNB và hình ảnh hiện thị trực tiếp lượng ADN được khuếch đại, cho thấy HNB đã phản ánh chính xác mức độ hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP trong các điều kiện nhiệt độ nghiên cứu. Theo đó, nhiệt độ 62°C hoặc 63°C là điều kiện phù hợp nhất cho phản ứng này. Kết hợp với những kết quả thu được từ thí nghiệm chuẩn hóa nhiệt độ đối với các cặp mồi nhận biết ADN phytoplasma, nhiệt độ 63°C sẽ là điều kiện phù hợp nhất cho tất cả các cặp mồi, khi được sử dụng đồng thời để nhận dạng phytoplasma gây bệnh chổi rồng trên cây sắn.

Tiếp theo, độ nhạy của các cặp mồi được đánh giá thơng qua thí nghiệm LAMP với nồng độ ADN được pha loãng từ 101-109 lần. Sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị HNB được thể hiện ở hình dưới đây (hình 26).

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) phát triển kít chẩn đoán phytoplasma gây bệnh chổi rồng trên sắn dựa trên kỹ thuật lamp (Trang 68 - 69)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(88 trang)