Hình 16. Điện di sản phẩm LAMP với nồng độ HNB khác nhau
A: Đánh giá kết quả theo chất chỉ thị màu. B: Kết quả điện di.
Mẫu (1, 2): 120 µM HNB. Mẫu (3, 4): 100 µM HNB. Mẫu (5, 6): 80 µM HNB. Mẫu 1, 3, 5: dương tính; mẫu 2, 4, 6: âm tính đối chứng
Hình ảnh điện di cho thấy, ở 3 nồng độ HNB khác nhau là 120 mM, 100 mM và 80 mM, q trình khuếch đại gen thơng qua phản ứng LAMP khá tương đồng, thể hiện ở số lượng băng ADN, độ dày và độ sáng của các băng điện di, chứng tỏ, các nồng độ HNB từ 80-120 mM không ảnh hưởng khác nhau đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP. Tuy nhiên, đánh giá theo mức độ thay đổi màu sắc cho thấy, ở nồng độ 100 mM, màu sắc của HNB trong phản ứng có bổ sung ADN khn chuyển sang màu xanh lam và nhạt hơn đáng kể so với mẫu đối chứng. Sự sai khác về màu sắc tại nồng độ này cũng khác biệt hơn hẳn so với nồng độ HNB 120 mM, trong khi ở nồng độ HNB 80 mM sự khác biệt màu sắc giữa mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng có ít sự khác biệt nhất. Do đó, nồng độ HNB 100 mM được đánh giá là nồng độ phù hợp để HNB thể hiện vai trò chỉ thị cho phản ứng một cách hiệu quả nhất. Như vậy, thơng qua thí nghiệm tìm kiếm chất chỉ thị màu phù hợp cho phản ứng LAMP, chất HNB có nồng độ 100 mM được lựa chọn làm chất chỉ thị màu cho các phản ứng LAMP tiếp theo trong nghiên cứu này.
HNB là một chất chỉ thị cho các kim loại kiềm thổ (Phân nhóm chính nhóm II trong bảng hệ thơng tuần hồn). Chúng được sử dụng như một chất chỉ thị màu hiệu quả trong việc xác định chính xác nồng độ ion Ca2+ ở pH=13 và ion Mg2+ ở pH=10, và được áp dụng để áp dụng từ năm 1970 cho các phân tích nước tự nhiên ở Nhật như biển hay sông nước với kết quả khả quan. Trong nghiên cứu sinh học phân tử HNB đã được Togo và các cs áp dụng để như một chất chỉ thị để nhận biết phản ứng LAMP xảy ra nhờ sự thay đổi hàm lượng Mg2+ do phản ứng tổng hợp chuỗi ADN mục tiêu, dưới hoạt tính xúc tác của enzyme Bst ADN Polymerase, trong môi trường kiềm (pH=8,8) [37]. Chất chỉ thị này sẽ thay đổi màu sắc theo sự thay đổi pH của dung dịch phản ứng. Theo đó, khi dung dịch chứa 8 mM Mg2+ và khơng có dNTP, thì HNB có màu đỏ tươi ở pH 8,6-9,0 và tím ở pH 8,4. Sau khi thêm 1,4 mM dNTP vào dung dịch này, màu sắc của HNB thay đổi từ đỏ sang tím khơng phụ thuộc vào độ pH [37]. Sự thay đổi màu sắc này gây ra bởi sự thay đổi nồng độ ion Mg2+ do phản ứng của các dNTP. Ngoài ra, báo cáo này cũng cho thấy, HNB có màu tím hoặc xanh tím ở nồng độ Mg2+ là 6 mM hoặc cao hơn, nhưng khi phản ứng tổng hợp ADN tiến triển, nồng độ Mg2+ giảm, và khi nồng độ này xuống dưới 6 mM, màu sắc của HNB thay đổi thành màu xanh lam báo hiệu phản ứng LAMP đã được tiến hành. Màu sắc của phản ứng LAMP trong nghiên cứu này: chuyển từ màu xanh tím sang màu xanh LAMP.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, nồng độ cuối cùng của dNTPs trong phản ứng này là 1.5 mM cho phép HNB luôn luôn tồn tại trong dung dịch phản ứng với màu xanh đậm. Bên cạnh đó, ion Mg2+ được sử dụng với nồng độ cuối cùng là 6mM, trong nghiên cứu này cho phép phát hiện nhanh chóng phản ứng có xảy ra hay không cho dù lượng phản ứng ở mức rất nhỏ do lượng Mg2+ đã chuyển xuống ngưỡng chuyển màu của HNB.
Ở một số nghiên cứu khác, màu của phản ứng âm tính có thể có màu xanh đậm, màu tím hoặc màu đỏ tươi. Như vậy, màu sắc ban đầu của HNB thế nào khơng có ý nghĩa quyết định cho vai trò chỉ thị, tuy nhiên, sự thay đổi màu sắc của nó mới có vai trị quyết định sự hình thành chuỗi ADN mới thơng qua phản ứng LAMP.
Ở một số nghiên cứu, ethidium bromide cũng được sử dụng như 1 chất chỉ thị cho phản ứng LAMP [1]. Cũng giống như nhuộm trong điện di gel agarose, ethidium bromide sẽ bám vào mạch ADN trong hỗn hợp và phát sáng khi được kích thích dưới tia cực tím. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này khơng sử dụng ethidium bromide vì độc tính, cũng như nguy cơ gây ung thư cho da và đường hơ hấp của hóa chất này. Hơn nữa, để bổ sung ethidium bromide, bắt buộc phải tiến hành sau khi diễn ra phản ứng khuếch đại, điều này làm tăng nguy cơ tạp nhiễm giữa các mẫu khác nhau, cũng như nhiễm nguồn ADN không mong muốn từ mơi trường bên ngồi. HNB được bổ sung ngay khi thực hiện thao tác trộn các thành phần của phản ứng, không những làm cho lượng HNB đồng đều trong các mẫu khác nhau ở cùng một lượt phản ứng mà còn hạn chế tối đa sự nhiễm tạp giữa các phản ứng khác nhau trong khi thao tác bổ sung ethidium bromide [38].
3.4.2. Kiểm tra kết quả thông qua kết tủa và điện di
Thí nghiệm kết hợp các điều kiện riêng biệt của phản ứng LAMP được tiến hành với nhiệt độ phản ứng là 63°C, chất chỉ thị màu HNB, cho kết quả như hình sau (hình 17).