Mẫu 1. Dương tính; Mẫu 2. Mẫu âm tính đối chứng. A. So sánh sự thay đổi màu sắc của HNB; B. So sánh sự xuất hiện kết tủa; C. Kết quả điện di.
Kết quả của phản ứng cho thấy, với màu sắc của HNB, nếu ở mẫu đối chứng, HNB có màu xanh đậm thì ở mẫu có bổ sung ADN khuôn, HNB chuyển sang màu xanh lam và nhạt hơn so với ban đầu. Sự thay đổi về màu sắc của HNB chứng tỏ đã xảy ra phản ứng khuếch đại gen trong mẫu có bổ sung ADN của phytoplasma.
Bên cạnh đó, phản ứng được kiểm chứng bằng điện di trên gel agarose, nhuộm ethidium và hiển thị dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm. Nếu như hai phương pháp kiểm tra dựa vào màu sắc hoặc sự hình thành kết tủa là cách phát hiện gián tiếp các thành phần khác nhau trong hỗn hợp phản ứng thì điện di là phương pháp kiểm tra trực tiếp sản phẩm ADN sau phản ứng khuếch đại, cũng là phương pháp truyền thống để xác nhận sản phẩm của các phản ứng khuếch đại ADN. Trong thí nghiệm này, trong khi mẫu đối chứng hồn tồn khơng có hiện tượng gì thì phản ứng LAMP có bổ sung ADN khn, các đoạn ADN có kích thước khác nhau được hiển thị trên gel chứng tỏ rằng chắc chắn phản ứng khuếch đại diễn ra (hình 17C).
Một sản phẩm phụ của phản ứng này, gốc pyrophotphat (P2O74-) sinh ra trong quá trình tổng hợp chuỗi ADN mới, đã kết hợp với ion Mg2+, làm giảm nồng độ ion Mg2+
trong mẫu. HNB là chất chỉ thị cho các ion kim loại hóa trị II như Ca2+, Mg2+..., nên sự thay đổi về nồng độ Mg2+ dẫn đến sự thay đổi màu sắc vật lý của HNB (hình 17A). Khơng những thế, sự kết hợp giữa ion Mg2+ với gốc pyrophotphate đã sinh ra một chất mới là magiepyrophotphat (Mg2P2O7) không tan trong dung dịch, tạo thành một lớp kết tủa trắng khi ly tâm sản phẩm sau phản ứng (hình 17B). Dựa vào lớp kết tủa ở đáy ống, có thể dễ dàng nhận biết được sản phẩm của phản ứng khuếch đại có được tạo thành hay khơng, từ đó phân biệt được những mẫu nghiên cứu có hay khơng những trình tự ADN mong muốn. Đây là cách phát hiện đơn giản nhưng có độ chính xác rất cao về kết quả của phản ứng.
Sự hình thành kết tủa làm cho việc kiểm tra kết quả của LAMP trở nên dễ dàng hơn, hiệu quả cao hơn, và dễ áp dụng hơn bởi khía cạnh kinh tế tiết kiệm hơn so với PCR. Tuy cùng là phản ứng khuếch đại gen và cùng sử dụng những nguồn nguyên liệu giống nhau nhưng PCR không thể tạo thành kết tủa magie pyrophotphat giống như LAMP bởi các lý do sau đây. Thứ nhất, do lượng pyrophotphat được tạo thành trong phản ứng PCR không đủ để quan sát thấy bằng mắt thường. Magie pyrophophat là sản phẩm phụ của quá trình khuếch đại ADN, do đó, lượng magie pyrophotphat cũng tỷ lệ thuận với lượng ADN được tạo thành. Nghiên cứu của Mori và cs (2001), chỉ ra rằng, trong phản ứng LAMP có thể tích 25 µl, cần tối thiểu 4 µg ADN được tạo thành, tương ứng với nồng độ magie
pyrophotphat lớn hơn 0.5 mM mới có thể được quan sát [74]. Tuy nhiên, lượng ADN được
tạo thành trong PCR chỉ khoảng 0,2 µg trong tổng thể tích 25 µl phản ứng, và nồng độ ion pyrophotphat được tạo thành tương ứng khoảng 0.02 mM, được đánh giá là không đủ khả năng tạo kết tủa có thể qua sát bằng mắt thường [35]. Trong khi đó, lượng ADN được tạo thành trong phản ứng LAMP có thể lớn hơn 10 µg, thậm chí có thể lên đến 400 µg
trong tổng số 25 µl hỗn hợp phản ứng, dẫn đến lượng magie pyrophotphat đủ lớn để lắng xuống đáy ống PCR. Thứ 2, điều kiện nhiệt độ cao trong mỗi chu kỳ của phản ứng PCR có thể phá hủy magie pyrophotphat, trong khi, dưới điều kiện đẳng nhiệt, phản ứng LAMP hồn tồn khơng có hiện tượng này [35].
Như vậy, thông qua phản ứng thử nghiệm và phân tích sản phẩm cho thấy, bộ mồi thiết kế cho phản ứng LAMP dựa trên trình tự 16S RNA của phytoplasma gây bệnh chổi rồng trên cây sắn hoàn tồn có thể được sử dụng để nhận biết nhanh lồi vi sinh vật này.
Sản phẩm của phản ứng có thể được nhận biết dễ dàng thông qua chất chỉ thị màu, hoặc sự xuất hiện của chất kết tủa hoặc xác nhận trực tiếp thông qua điện di gel agarose.
3.5. Độ nhạy của phản ứng
Với hai bộ mồi được thiết kế cho phản ứng LAMP, một thí nghiệm tiếp theo được tiến hành đề đánh giá độ nhạy của mồi, đồng thời, xác định được lượng ADN nhỏ nhất mà phản ứng LAMP có thể nhận biết được với cặp mồi tương ứng với ADN khuôn. Bằng cách pha loãng ADN mục tiêu nhiều lượt khác nhau, mỗi lượt pha loãng, nồng độ ADN lại giảm xuống 10 lần và kiểm tra hiệu quả của phản ứng được kiểm tra dựa vào sự thay đổi màu sắc của HNB và kiểm chứng trực tiếp thông qua điện di gel agarose, thu được kết quả như hình 18-21.
Bộ mồi thứ nhất
Đối với bộ mồi thứ nhất, khi pha loãng nồng độ ADN phytoplasma ban đầu từ 101- 106 lần, chất chỉ thị màu HNB vẫn tiếp tục thay đổi theo chiều hướng nhạt dần, chứng tỏ phản ứng LAMP vẫn diễn ra theo điều kiện về nhiệt độ phản ứng đã được thiết kế từ thí nghiệm trước. Tiếp tục pha loãng nồng độ ADN phytoplasma thêm 10 và 100 lần từ nồng độ cuối cùng, thu được nồng độ pha loãng mới là 10-7 và 10-8 so với nồng độ ADN phytoplasma ban đầu và tiến hành phản ứng, kết quả cho thấy, ở nồng độ ADN 10-7 so với ban đầu, mức thay đổi màu sắc đã ít đi và đối với nồng độ ADN 10-8, sự thay đổi màu HNB dường như không đáng kể so với mẫu đối chứng ban đầu. Với kết quả này cho thấy, chất chỉ thị màu HNB có giới hạn phân biệt phản ứng LAMP diễn ra ở nồng độ ADN phytoplasma là 10-7 lần so với ban đầu.
Kiểm tra độ nhạy của phản ứng bằng điện di sản phẩm trên gel agarose 2% cho thấy, khi ADN khn được pha lỗng 108 lần, sản phẩm điện di vẫn hiện băng ADN (mặc dù rất mờ nhạt) chứng tỏ rằng, ngay cả khi ADN khn có nồng độ rất thấp, các cặp mồi đặc hiệu vẫn có khả năng phát hiện và khuếch đại thành các sản phẩm thông qua phản ứng LAMP.