Để đảm bảo các cặp mồi và mẫu dò được sử dụng trong các phản ứng real- time PCR phát hiện đột biến kháng isoniazid, Rifampin và ethambutol là đặc hiệu đối với MTB, các phản ứng real-time PCR giữa các cặp mồi và mẫu dò thiết kế cùng với DNA tách chiết của một số đối tượng vi sinh vật khác (CMV, EBV, HCV, HPV, HBV) sẽ được thiết lập. Các mẫu DNA này đã được xác định dương tính với bộ kit chẩn đốn do Cơng ty Cổ phần Cơng nghệ Việt Á cung cấp.
Hệ primer, mẫu dò được xem là đặc hiệu đối với các đột biến kháng thuốc của MTB sẽ cho kết quả dương tính với mẫu chứng dương và cho kết quả âm tính với mẫu chứng âm và các chủng vi sinh vật khác.
3.9.1 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 1- xác định đột biến kháng isoniazid
Chúng tôi sử dụng mẫu VA315 đã được xác định đột biến kháng isoniazid bằng phương pháp giải trình tự làm chứng dương. Kết quả mẫu VA315 đường tín hiệu lên cao vượt tín hiệu nền, các mẫu chứng dương với CMV, EBV, HCV, HPV, HBV đều cho kết quả âm tính. Như vậy primer và mẫu dò thiết kế đặc hiệu với MTB.
Hình 3.41: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu phản ứng 1
3.9.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 2- xác định đột biến kháng Rifampin
Hình 3.42: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 2
Chúng tôi sử dụng mẫu VA516 đã được xác định đột biến kháng Rifampin bằng phương pháp giải trình tự làm chứng dương. Kết quả mẫu VA516 đường tín hiệu lên cao vượt tín hiệu nền, các mẫu chứng dương với CMV, EBV, HCV, HPV, HBV đều cho kết quả âm tính. Như vậy primer và mẫu dị thiết kế đặc hiệu với MTB.
VA315 +CMV +EBV +HCV +HPV +HBV VA516 +CMV +EBV +HCV +HPV +HBV
3.9.3 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 3 và 4 - xác định đột biến kháng ethambutol ethambutol
Hình 3.43: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng 3 và 4
Thí nghiệm này chúng tơi thực hiện luôn với cả hai phản ứng xác định đột biến kháng ethambutol. Mẫu chứng dương VA306GA và VA306AG đã được xác định có đột biến kháng thuốc với ethambutol được Công ty Cổ phần Công Nghệ Việt Á cung cấp. Kết quả 2 mẫu đột biến ethambutol đều cho kết quả tốt, mẫu dương tính với CMV, EBV, HPC, HCV và HBV đều cho kết quả âm tính, chứng tỏ mẫu khơng bị nhiễm trong quá trình thao tác và hệ mồi và mẫu dò đặc hiệu với MTB. +CMV +EBV +HCV +HPV +HBV VA306GA VA306AG